H型高血圧ラットにおけるHuotan Jiedu Tongluo煎じ薬の降圧効果と機序

要約

ここでは、H型高血圧を誘発し、胃内に投与されたHuotan Jiedu Tongluo煎じ薬(HTJDTLD)の降圧効果を評価するためのプロトコルを紹介します。H型高血圧のラットでは、HTJDTLDは効果的な降圧効果を示し、おそらく小胞体(ER)ストレス誘発性アポトーシス経路の活性化の阻害と関連していました。.

要約

血漿ホモシステイン(Hcy)レベルの上昇を特徴とする高血圧の特定の形態であるH型高血圧症は、世界中で主要な公衆衛生上の課題となっています。この研究では、血管狭窄の治療に一般的に使用される非常に効果的な伝統的な漢方薬処方であるHuotan Jiedu Tongluo煎じ薬(HTJDTLD)の降圧効果と根本的なメカニズムを調査しました。ラットのH型高血圧症の誘発にはメチオニンを用い、HTJDTLDを胃内に投与した。次に、ラットの尾側動脈の収縮期血圧と拡張期血圧を非侵襲的ラット尾側マノメトリーによって測定しました。大動脈の組織学的評価は、ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色によって行われました。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用してHcyレベルを測定し、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)およびウェスタンブロッティングを使用して、グルコース調節タンパク質78(GRP78)、腫瘍壊死因子(TNF)受容体関連因子2(TRAF2)、c-Jun N末端キナーゼ(JNK)、およびカスパーゼ-3のmRNAおよびタンパク質レベルを決定しました。その結果、HTJDTLDはメチオニン治療後に血圧を有意に低下させ、病理組織学的病変を緩和し、Hcyレベルを低下させることが示されました。さらに、HTJDTLDは、主に小胞体(ER)ストレス誘発性アポトーシス経路に関与するGRP78、JNK、TRAF2、およびカスパーゼ3の遺伝子およびタンパク質の発現を有意に阻害しました。全体として、結果は、HTJDTLDがH型高血圧のラットに効果的な降圧効果を示し、ERストレス誘発性アポトーシス経路活性化の阻害に関連する降圧メカニズムを明らかにしました。

概要

高血圧は、心臓発作、脳卒中、腎不全の主要な危険因子であり、世界中で10億人が罹患する公衆衛生上の大きな課題となっています¹。チオール基含有アミノ酸であるホモシステイン(Hcy)は、メチオニン代謝の重要な代謝中間体です。血漿Hcyレベルが上昇した高血圧は、H型高血圧症と定義され^、脳卒中などの心脳血管疾患の発生と再発の重大な危険因子となる可能性があります^2,3。最近の研究では、H型高血圧症の併存が心血管疾患や脳血管疾患の副作用を悪化させる可能性があることが報告されています⁴。特に、中国のH型高血圧症の患者の75%が原発性高血圧症であり、これは生活の質に深刻な影響を及ぼしています⁵。現在、H型高血圧症の治療には主に西洋医学が含まれています。ただし、特定の副作用やコンプライアンスの低下を引き起こす可能性があり、H型高血圧の包括的な管理のニーズを満たすことができなくなりました。

中国伝統医学(TCM)は、中国で2,000年以上の歴史を持つユニークなリソースです。西洋医学における高血圧コントロールのアンメットニーズにより、臨床医は H型高血圧症の予防と治療におけるTCMの潜在的な役割を検討し始めています⁶。Huotan Jiedu Tongluo Decoction (HTJDTLD) は、Yue Deng 教授が広範な臨床専門知識から考案した伝統的な漢方薬の処方です⁷.HTJDTLDは、20年以上にわたる臨床応用を通じて、心血管疾患や脳血管疾患の治療において顕著な有効性を示してきました¹。しかし、HTJDTLDがH型高血圧症に治療効果があるかどうかは報告されていません。そこで、H型高血圧ラットにおけるHTJDTLDの降圧効果と特異的なメカニズムを探り、H型高血圧の治療薬候補を特定することを目指しました。

プロトコル

すべての動物実験は、長春中医薬大学の動物実験委員会(IACUC)によって承認されました。材料は 資料表に記載されています。

1. 動物と治療

1. 合計 50 匹の成体自然高血圧ラット (SHR) (雄、50 日齢) を、対照 (CON)、メチオニン (MET)、MET + HTJDTLD + マレイン酸エナラプリル (EM)、MET + EM、および MET + HTJDTLD グループの 5 つのグループに無作為に分けます。
   注:実験ラットは、彼らの快適さと健康を確保するように設計された制御された環境に収容されました。この施設は、一定の22°C、相対湿度40〜60%に設定された温度管理された部屋を特徴としていました。ハウジングケージは透明なポリカーボネート製で、各ラットが自由に動き回れる十分なスペースを確保しました。照明スケジュールは、12時間の明暗サイクルに従い、自然光の日光条件をシミュレートしました。ラットには十分な餌と水が与えられました。
2. ラットに次の食事を28日間与えます。
   1. MET群のラットに3%メチオニン食を28日間与えて、H型高血圧を誘発します。
   2. MET + HTJDTLD + EM群のラットを、HTJDTLD(1.633 g / mL)およびEM(0.2 mg / mL)を1 mL / kgの用量で胃内に投与します。
   3. MET + EMおよびMET + HTJDTLDグループのラットに、3%メチオニン食に加えて、それぞれHTJDTLDまたは強制経口投与により投与します。
      注:HTJDTLDは、 Fructus Trichosanthis (20 g)、 Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae (15 g)、 Lonicerae japonicae flos (30 g)、 Radix et Rhizoma Nardostachyos (15 g)、 Radix Angelicae sinensis (15 g)、 Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (10 g)、 Hirudo (5 g)、 Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae (15 g)、および Radix Scrophulariae (15 g)で構成され、以前に報告された⁷と同様に煎じ薬されました.EMを精製水(0.2 mg/mL)に溶解した液剤は、ポジティブコントロールとして作用しました。

2.血圧測定

注:血圧測定は、非侵襲的血圧計(材料の表)を使用して行われます。

1. 28日間の治療後、各グループのラットを12時間絶食し、血圧を測定します。
2. ネズミのサイズに合った拘束装置を選択してください。この研究で使用された拘束装置は、円筒形の拘束メッシュ、キャンバス カバー、サーマル チューブ、および安定化フォーム パッドで構成されています。ラットを拘束メッシュに置き、拘束メッシュをサーマルチューブに入れてから、サーマルチューブをキャンバスカバーに入れます。
3. 信号ケーブルをカバーの下の適切な位置に置きます。ラットの尻尾をカバーの隙間に置き、スタビライジングフォームパッドに固定します。測定には、空いていて、静かで、暖かい環境が好まれます。ラットが測定環境に適応できるように、ラットを20〜30分前に測定場所に移動します。
   注:ステップ2.2-2.3は、ラットを安定させるために数回実行できます。数回のトレーニングセッションの後、ラットはそれに慣れ、非常に迅速に安定することができるので、その後の血圧測定に便利です。
4. 加圧センサーのエアホース接続、信号接続、保持チューブを接続します。加圧センサーをテールの先端に配置します。
5. 血圧を測定します。ラットテールをセンサーに挿入した後、パルス波が表示されます。 Start/Stop を押して、測定を開始/停止します。
   注意: デバイスは、ラットの尻尾がセンサーに挿入されているかどうかを自動的に判断します。ラットの尻尾が挿入されていないと、加圧センサーは加圧を開始せず、測定を行いません。
6. 血圧テストが完了すると、 結果 メニューが自動的にポップアップ表示されます。測定の平均値、標準偏差(SD)、標準誤差(SE)、変動係数(CV)を 結果 メニューで確認します。
   注:各ラットの血圧を2分以上の間隔で3回測定し、平均値を計算しました。
7. 血圧を測定した後、過剰な 2% ペントバルビタールナトリウム (100 mg/kg) の腹腔内注射によりラットを安楽死させます。次に、外科用ハサミと歯付き鉗子を使用して、会陰から首までラットを層ごとに解剖します。胸部と腹部の内容物を裏返し、2つの腎臓の間の腹部大動脈分岐部に移動し、大動脈弓の一部まで大動脈を収集します。

3. ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色

1. 大動脈血管組織を4%パラホルムアルデヒドに少なくとも24時間固定します。
2. 血管標本を採取し、グラジエントアルコールで脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンに埋め込みます。
3. 埋め込み後、厚さ3〜5mmの連続スライスを作成します。スライスを60〜70°Cで乾燥させ、室温(RT)で保存します。
4. 切片をキシレンIに30分間、キシレンIIに30分間、100%アルコールIに10分間、100%アルコールIIに10分間、95%アルコールIに5分間、95%アルコールIIに5分間、80%アルコールに5分間浸し、蒸留水ですすいでください。
5. ハリスヘマトキシリンの切片を5分間染色し、水道水で5分間すすぎます。1%塩酸アルコールで10秒間分化し、水道水で15分間十分にすすいでください。切片をアンモニア水で5秒間洗浄し、水道水で15分間十分にすすいでください。
6. 顕微鏡観察を行い、エオシンで10分間染色し、水道水で15分間十分にすすいでください。
7. 切片を80%エチルアルコールに10秒間、95%アルコールIに5分間、95%アルコールIIに5分間、100%アルコールIに10分間、100%アルコールIIに10分間、キシレンIに10分間、キシレンIIに10分間浸漬して脱水します。
8. 中性ガムを使用してセクションを密封します。
9. 大動脈組織の組織学的変化を光学顕微鏡(対物レンズ100倍、倍率1000倍)で観察します。

4. マッソンのトリクローム染色

1. HE染色と同様のルーチンの脱ロウを行います。
2. ヘマトキシリン染色:スライドをヘマトキシリン溶液に10分間浸し、すぐに水道水ですすいでください。
3. スライドを1%塩酸溶液に数秒間浸し、直後に水道水ですすいでください。
4. スライドをリヒテンシュタイン酸性マゼンタ染色剤に5分間浸し、水ですすいでください。
5. スライドを1%ホスホモリブデン酸に5分間浸します。
6. スライドを2%アニリンブルー染色液に5分間浸漬し、1%氷酢酸浸漬洗浄液に1分間浸漬します。その後、スライドを95%アルコールで3回急速にドロップウォッシュします。
7. HE染色と同様に、日常的な脱水、透明性、および中性ガムのシーリングを実行します。

5. ELISAによるHcy測定

1. ラットに2%ペントバルビタールナトリウム(45 mg / kg)の腹腔内注射で麻酔をかけ、つま先をつまんで麻酔の深さを確認します。採血時に接触を避けるために、ラットを保持し、ひげを切り落とします。湾曲した鉗子でラットの眼球を取り出し、準備した滅菌微量遠心チューブに血液を採取します。次に、過剰な 2% ペントバルビタールナトリウム (100 mg/kg) の腹腔内注射でラットを安楽死させます。
2. RTで血液が10〜20分間自然に凝固するのを待ってから、血液を2〜8°Cで約20分間遠心分離(626-1409 x g)します。
3. 上澄みを慎重に収集し、-80°Cの冷蔵庫に保管します。
4. キットの指示に従って、試験管内で標準を希釈します。
5. ブランクウェル(ブランクコントロールウェルにサンプルと酵素試薬は追加されず、残りのステップは同じです)、標準ウェル、およびテストするサンプルウェルをセットアップします。プレートに50 μLの標準試料を、サンプルウェルに40 μLのサンプル希釈液を、さらに10 μLの血清を加えます(サンプルの最終希釈は5倍です)。
   注:サンプルをプレートのウェルの底に追加します。井戸の壁に触れないようにし、穏やかに振って混ぜます。
6. プレートをシーリングフィルムでシールし、37°Cで30分間インキュベートします。
7. 30倍に濃縮した洗浄液を蒸留水で30倍に希釈し、使用する準備をします。
8. シーリングフィルムを慎重に剥がし、液体を捨て、振ってすべての液体を取り除きます。各ウェルに洗浄液を入れ、30秒間放置して廃棄します。これを5回繰り返し、軽くたたいて乾かします。
9. ブランクウェルを除く各ウェルに50 μLの酵素試薬を添加します。
10. シーリングフィルムを使用してプレートをシールし、37°Cで30分間インキュベートします。
11. 手順5.8を繰り返します。
12. 各ウェルに50 μLのカラー現像剤Aを加え、次に50 μLのカラー現像剤Bを加え、穏やかに振ってよく混ぜます。37°Cで10分間、低照度下でインキュベートします。
13. 各ウェルに50μLの停止溶液を加えて反応を終了します(青色が黄色に変わります)。
14. ブランクウェルで反応をゼロにし、各ウェルの吸光度(OD値)を450nmで順次測定します。
    注:測定は、停止溶液の添加後15分以内に実行する必要があります。

6. RNA抽出と定量的RT-PCR

1. 全RNAを抽出します。
   1. 新鮮な大動脈組織を適切なサイズ(30〜50 mg /個)にすばやく切断し、液体窒素で完全に粉砕します。.Trizol試薬1 mLを加え、よく混合し、氷上で10分間インキュベートして組織を溶解します。
   2. 2250 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清をペレットなしの新しい微量遠心チューブに慎重に移します。
   3. 200 μLのクロロホルムを加え、15秒間激しく振とうし、室温で5分間インキュベートします。
   4. 2250 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 混合物は、下部のフェノール-クロロホルム有機相、中間相、および上部の水性相の3つの層に分割されます。
   5. 上部水相を新しい微量遠心チューブ(トリゾールの約60%容量)に慎重に移します。中間期を吸引しないでください。少量の上液を残すことができます。
   6. 等量のイソプロパノールを加え、約10回反転させて穏やかに混合し、室温で10分間放置します。
   7. 2250 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を捨て、RNA沈殿物を1mLの75%エタノールで2回洗浄します。
   8. 2250 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨て、室温で5〜10分間風乾します。
   9. 15-50μLのジエチルピロカーボネート(DEPC)水にRNAを溶解し、RNA濃度を確認します。
2. 逆転写とRT-qPCRの実施(表1)
   1. 小胞体ストレス(ERS)とアポトーシスに関連する遺伝子発現をqRT-PCRで検出します。ステップ6.1で抽出したトータルRNAを使用し、製造元の指示に従ってcDNA合成キットを使用してcDNAに逆転写します。
   2. 反応容量20 μLのSYBR Green PCRマスターミックスを用いたリアルタイムPCR検出システムを使用して、遺伝子発現を測定します。
   3. 2^−ΔΔCT法によりデータを定量的に解析し、β-アクチンの発現に対するn倍差で表します。プライマーを 表2に示します。

7. ウェスタンブロッティング(WB)

1. 全組織タンパク質を抽出します。
   1. 1-2mLホモジナイザーの球状部分にティッシュブロックを少量入れ、清潔なハサミでティッシュブロックをできるだけカットします。
   2. 400 μL (w:v=1:10) の RIPA 溶解バッファーを添加し、ホモジナイズします。次に、氷の上に置きます。数分後、もう一度挽いて氷の上に置きます。粉砕プロセスを数回繰り返します。
   3. 30分間の溶解後、ピペットを使用してライセートを1.5 mLの遠心チューブに移し、チューブを予冷した4°Cの遠心分離機に入れます。2250 x g で10分間遠心分離し、上清を新しい1.5 mL遠心チューブに移します。
2. タンパク質を定量します。
   1. キットの指示に従ってタンパク質標準を希釈します。標準試料のグラジエントを 0、25、125、250、500、1000、1500、2000 ng/μL で取得します。
   2. タンパク質サンプル2.5μLを採取し、サンプル希釈液を使用して25μL(10倍)に希釈します。
   3. 96ウェルプレートを用意し、20 μLの標準タンパク質サンプル(濃度勾配による)と標的タンパク質をウェルに加えます(各ターゲットタンパク質サンプルにつき2ウェル)。
   4. 液体Aと液体Bを50:1の割合で混合して現像液(すぐに使用できる状態)を調製し、各ウェルに200μLの現像液を加えます。
   5. サンプルを添加した96ウェルプレートをインキュベーターに37°Cで30分間置きます。
   6. 562nmの吸光度を検出します。
   7. 測定するタンパク質の濃度を計算します。
      1. 標準タンパク質濃度を垂直座標、562 nmの吸光度を水平座標として、標準曲線を描画します。
      2. 標準曲線から得られた式と測定された標的タンパク質の吸光度に基づいて、標的タンパク質の濃度を計算します。
   8. 180 μLのローディングバッファーを、マイクロ遠心チューブ内の20 μLのタンパク質サンプルに加えます。遠心分離管を金属製の浴槽に入れ、100°Cで10分間変性させます。変性タンパク質WBを使用するか、-20°Cで保存してください。
3. イムノブロッティングを行います。
   1. タンパク質電気泳動ゲルを設定します。
      1. ゲルキャスティングガラスプレート(1 mmまたは1.5 mm)を洗浄してブロードライし、ゲルキャスティング装置に固定します。
      2. 表3に従って10%分離ゲルを調製します。ガラスプレートの間に構成した分離ゲルを追加します。気泡の発生を避けるために、ゲル溶液をゆっくりと加えます。次に、無水エタノールを適量加えて、セパレーターの液面を平らにします。ゲルが固まるまで、RTで20〜30分間放置します。
         注:分子量が高いほど、他の濃度の分離接着剤を配合する必要性に応じて、接着剤の濃度は低くなります。
      3. 表3に従って5%濃縮ゲルを調製します。分離ゲルが固まった後、無水エタノールの上層を流し出し、濃縮ゲルを充填し、ガラスプレートに合わせたゲルコームをゆっくりと挿入します(気泡が入らないように注意してください)。濃縮ゲルが固まるまで、室温で20〜30分間放置します。
   2. 電気泳動を行います。
      1. トリス60.5g、グリシン375g、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)20gを計量します。2Lに水を加え、60°Cで加熱し、攪拌して溶解させ、10倍電気泳動溶液を形成します。解決策はRTにあります。使用するときは1倍に希釈してください。
      2. ゲルキャスティング装置から接着剤の入ったガラス板を取り外し、水流の接着剤コームを一定の速度で引き下げると同時に、サンプリング穴の気泡を排出します。
      3. 電気泳動タンクにガラスプレートを固定し、設定した1x電気泳動溶液を加えます。内側のタンクがいっぱいで、外側のタンクが内側のタンクの半分であることを確認してください。
      4. 同質量のタンパク質サンプルと5 μLのマーカー(タンパク質のサイズを示すために使用)をサンプル添加ウェルに加えます。
      5. ゲルを60Vで20分間、次に100Vで90分間、ローディングバッファーが底まで泳ぐまで泳がせます。
   3. メンブレン転写を行います。
      1. トリス60gとグリシン288gを秤量し、2Lに水を加えます溶液をよく攪拌して溶解し、10x膜転写溶液を作り、RTで保存します1:2:7(10x膜貫通溶液:メタノール:水)の比率で希釈して1xワーキング溶液を作ります。
         注:膜貫通型溶液は事前に調製し、冷蔵庫で4°Cに冷却する必要があります。
      2. PVDFをメタノールに適切な時間(0.5〜1分)浸して、メンブレン上の正に帯電した基を活性化し、負に帯電したタンパク質と結合しやすくします。
      3. メンブレントランスファークリップを取り、コンポーネントを順番に配置した後、固定します(黒色の表面-スポンジ-フィルター紙-電気泳動ゲル-PVDFメンブレン-フィルターペーパー-スポンジ-白い表面の順番)。
         注意: 気泡を避けるように注意してください。気泡がある場合は、ローラーを使用して気泡を追い出します。
      4. スプリントをメンブレントランスファータンクに置き、正しい電極の配置に注意を払い、タンクに2つのアイスバッグを入れ、1xメンブレントランスファーリキッドで満たします。最後に、膜貫通タンク全体を氷の中に置きます。
      5. 膜移送条件を100Vにして1時間。
         注:膜転写時間は、タンパク質のサイズに応じて調整できます。タンパク質の分子量が小さいほど、膜移動時間は短くなります。
   4. ブロッキングを実行します。
      1. リン酸化タンパク質の場合は、ブロッキング溶液として5% BSA(溶媒TBST)を使用します。非リン酸化タンパク質の場合は、ブロッキングに5%スキムミルク(溶媒TBST)を使用します。
      2. ブロッキング溶液を適切なサイズの皿に注ぎます。PVDFメンブレンをディッシュに入れ、PVDFメンブレンがブロッキング溶液に沈んでいることを確認します。皿を閉じ、RTで1時間インキュベートします。
      3. メンブレンを取り外します。マーカーの表示と各標的タンパク質のサイズに応じて、メンブレンを適切なサイズにカットし、シリアル番号でラベル付けします。
   5. 抗体をインキュベートします
      1. ブロッキング液を取り除き、残った液体を濾紙で吸収します。対応するカットPVDFを対応する抗体希釈液(CPR78 [1:1000]、TRAF2 [1:1000]、p-JNK [1:1000]、カスパーゼ[1:1000]、GAPDH [1:1000]を含む)に入れ、4°Cのロータリーシェーカーに一晩置いてください。
      2. TBSTを1倍加え、RTで3回(各10分)すすぎます。
      3. PVDFメンブレンを二次抗体希釈液中でメーカーの指示に従ってインキュベートし、室温で1時間インキュベートします。
      4. 1x TBSTをRTで3回(各10分)加えてメンブレンをすすぎます。
   6. PVDFメンブレンを開発します。
      1. 発光溶液キットに同量の液体Aと液体Bを混合し、よく振とうして使用準備します。
      2. PVDF膜をラップフィルムに載せて広げ、準備した発光剤を膜にすばやく均一に均一に加えます。光を避けて室温で3分間インキュベートします。
      3. Enhanced Chemiluminescence(ECL)ウェスタンブロッティング検出試薬を使用してタンパク質バンドを検出します。

8. データ分析

1. すべてのデータを平均±S.D.として表し、SPSS 20.0ソフトウェアを使用して一元配置分散分析による統計分析を実行します。 p が0.05の場合<統計的に有意な差を考慮します。

結果

表4および表5に示すように、収縮期血圧(SBP)および拡張期血圧(DBP)は、1週間から4週間まで、MET群の方がCON群よりも有意に高かった。HTJDTLD処理後、ラットのSBPおよびDBPはMET群のSBPおよびDBPよりも有意に低かった。特に、HTJDTLDとEMの併用は、HTJDTLD治療単独よりも強い降圧効果を示しました。

HE染色とMassonのトリクローム染色によれば、大動脈血管壁?...

ディスカッション

高血圧は、成人人口の3分の1が罹患し、脳卒中、冠状動脈性心臓病、^心不全、腎不全などのリスクを高める最も一般的な心血管疾患の1つです8。H型高血圧症は、原発性高血圧症とホモシステイン濃度の上昇が同時に起こることを指す特殊なタイプの高血圧症であり、長年にわたって広く注目を集めてきました⁹。近年、経口EMと降圧薬の併用により、血圧の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR	Yeasen,China	11149ES	cDNA synthesis kit
Anti-beta-actin antibody	Bioss, China	bs-0061R
Anti-caspase-3 antibody	Bioss, China	bs-0081R
Anti-GPR78 antibody	Abcam, USA	ab108513
Anti-JNK antibody	Abcam, USA	ab76572
Anti-p-JNK antibody	Bioss, China	bsm-52462R
Anti-rabbit IgG antibody	Bioss, China	bs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 antibody	Bioss, China	bs-22372R
Bio-Rad CFX96 Touch system	Bio-Rad	CFX96	real-time PCR detection system
ECL Western Blot Substrates	Merck, MA, USA	WBULP-10ML
Enalapril maleate folic acid tablets	Yangzijiang Pharmaceutical Company, China	20040991
FastStart SYBR Green Master	Sigma	FSSGMMRO
Fructus Trichosanthis	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Hirudo	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
intelligent noninvasive sphygmomanometer	Beijing Softron Biotechnology company	BP-2010A
Lonicerae Japonicae Flos	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Methionine	Sigma, USA	M9500
Radix Angelicae Sinensis	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Radix et Rhizoma Glycyrrhizae	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Radix et Rhizoma Nardostachyos	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Radix et Rhizoma Rhodiolae Crenulatae	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Radix Scrophulariae	The First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, China	No catalog number
Rat Hcy ELISA Kits	Shanghai Meimian Industrial Company, China	MM-0293R2
RIPA buffer	Shanghai Beyotime Biotechnology company	P0013B