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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per indurre l'ipertensione di tipo H e valutiamo gli effetti antipertensivi del decotto di Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD) somministrato per via intragastrica. Nei ratti con ipertensione di tipo H, HTJDTLD ha avuto efficaci effetti antipertensivi, probabilmente associati all'inibizione dell'attivazione della via dell'apoptosi indotta dallo stress del reticolo endoplasmatico (ER).

Abstract

L'ipertensione di tipo H, che è una forma specifica di ipertensione caratterizzata da elevati livelli plasmatici di omocisteina (Hcy), è diventata una delle principali sfide per la salute pubblica in tutto il mondo. Questo studio ha studiato gli effetti ipotensivi e i meccanismi alla base del decotto di Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD), una formula di medicina tradizionale cinese altamente efficace comunemente usata per trattare la stenosi vascolare. La metionina è stata utilizzata per indurre l'ipertensione di tipo H nei ratti e l'HTJDTLD è stato somministrato per via intragastrica. Quindi, le pressioni arteriose sistolica e diastolica dell'arteria caudale dei ratti sono state misurate mediante manometria caudale di ratto non invasiva. La valutazione istologica dell'aorta è stata eseguita mediante colorazione con ematossilina-eosina (HE). Per misurare i livelli di Hcy è stato utilizzato il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e la reazione a catena quantitativa della polimerasi trascrittasi inversa (qRT-PCR) e il western blotting sono stati utilizzati per determinare i livelli di mRNA e proteine della proteina regolatrice del glucosio 78 (GRP78), del fattore 2 associato al recettore del fattore di necrosi tumorale (TNF), delle chinasi N-terminali c-Jun (JNK) e della caspasi-3. I risultati hanno mostrato che HTJDTLD ha abbassato significativamente la pressione sanguigna, alleviato le lesioni istopatologiche e diminuito i livelli di Hcy dopo il trattamento con metionina. Inoltre, HTJDTLD ha inibito significativamente l'espressione genica e proteica di GRP78, JNK, TRAF2 e caspasi 3, che sono coinvolti principalmente nella via dell'apoptosi indotta da stress del reticolo endoplasmatico (ER). Nel complesso, i risultati hanno indicato che HTJDTLD ha avuto effetti antipertensivi efficaci nei ratti con ipertensione di tipo H e ha rivelato i meccanismi antipertensivi associati all'inibizione dell'attivazione della via dell'apoptosi indotta dallo stress ER.

Introduzione

L'ipertensione, uno dei principali fattori di rischio per infarto, ictus e insufficienza renale, è diventata una sfida significativa per la salute pubblica che colpisce 1 miliardo di persone in tutto il mondo. L'omocisteina (Hcy), un amminoacido contenente il gruppo tiolico, è un intermediario metabolico vitale del metabolismo della metionina. L'ipertensione con elevati livelli plasmatici di Hcy è definita come ipertensione di tipo H, che potrebbe essere un fattore di rischio significativo per l'insorgenza e la recidiva di malattie cardiocerebrovascolari come l'ictus 2,3. Studi recenti hanno riportato che la co-residenza dell'ipertensione di tipo H potrebbe aggravare gli effetti collaterali delle malattie cardiovascolari e cerebrovascolari4. In particolare, il 75% dei pazienti in Cina con ipertensione di tipo H soffre di ipertensione primaria, che influisce gravemente sulla qualità della vita5. Attualmente, il trattamento dell'ipertensione di tipo H comprende principalmente la medicina occidentale. Tuttavia, può causare alcuni effetti avversi e una scarsa compliance e non può più soddisfare le esigenze di una gestione completa dell'ipertensione di tipo H.

La medicina tradizionale cinese (MTC) è una risorsa unica con una storia di oltre 2.000 anni in Cina. A causa dell'esigenza insoddisfatta di controllo dell'ipertensione nella medicina occidentale, i medici hanno iniziato a considerare il potenziale ruolo della MTC nella prevenzione e nel trattamento dell'ipertensione di tipo H6. Il decotto di Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD) è una formula di medicina tradizionale cinese formulata dal professor Yue Deng, attingendo alla sua vasta esperienza clinica7. Nel corso di oltre 20 anni di applicazione clinica, HTJDTLD ha dimostrato una notevole efficacia nel trattamento delle malattie cardiovascolari e cerebrovascolari1. Tuttavia, non è stato riportato se l'HTJDTLD abbia effetti terapeutici nell'ipertensione di tipo H. Pertanto, abbiamo mirato a esplorare gli effetti antipertensivi e i meccanismi specifici di HTJDTLD nei ratti con ipertensione di tipo H e identificare potenziali farmaci terapeutici per il trattamento dell'ipertensione di tipo H.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università di Medicina Cinese di Changchun. I materiali sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Animali e trattamento

  1. Dividere casualmente un totale di 50 ratti adulti spontaneamente ipertesi (SHR) (maschi, 50 giorni di età) in cinque gruppi, inclusi i gruppi di controllo (CON), metionina (MET), MET + HTJDTLD + Enalapril maleato (EM), MET + EM e MET + HTJDTLD.
    NOTA: I ratti sperimentali sono stati alloggiati in un ambiente controllato progettato per garantire il loro comfort e benessere. La struttura era dotata di ambienti a temperatura controllata e impostata a 22 °C costanti, con un'umidità relativa del 40-60%. Le gabbie di alloggiamento sono state realizzate in policarbonato trasparente, fornendo ampio spazio a ciascun ratto per muoversi liberamente. Il programma di illuminazione ha seguito un ciclo luce/buio di 12 ore, simulando le condizioni di luce naturale del giorno. Ai ratti è stato fornito cibo e acqua adeguati.
  2. Fornire ai ratti la seguente dieta per 28 giorni.
    1. Somministrare ai ratti del gruppo MET una dieta a base di metionina al 3% per 28 giorni per indurre l'ipertensione di tipo H.
    2. Somministrare i ratti nel gruppo MET + HTJDTLD + EM per via intragastrica con HTJDTLD (1,633 g/mL) e EM (0,2 mg/mL) alla dose di 1 mL/kg quando i ratti in aggiunta alla dieta a base di metionina al 3%.
    3. Somministrare ai ratti dei gruppi MET + EM e MET + HTJDTLD con HTJDTLD o EM mediante gavage, rispettivamente, oltre alla dieta a base di metionina al 3%.
      NOTA: L'HTJDTLD è costituito da Fructus Trichosanthis (20 g), Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae (15 g), Lonicerae japonicae flos (30 g), Radix et Rhizoma Nardostachyos (15 g), Radix Angelicae sinensis (15 g), Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (10 g), Hirudo (5 g), Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae (15 g) e Radix Scrophulariae (15 g), ed è stato decotto come precedentemente riportato7. L'EM disciolto in acqua purificata (0,2 mg/mL) è servito come controllo positivo.

2. Misurazione della pressione sanguigna

NOTA: Le misurazioni della pressione sanguigna vengono eseguite utilizzando uno sfigmomanometro non invasivo (Tabella dei materiali).

  1. Dopo il trattamento per 28 giorni, digiunare i ratti di ciascun gruppo per 12 ore e misurare la pressione sanguigna.
  2. Scegli un dispositivo di ritenuta che corrisponda alle dimensioni del ratto. Il dispositivo di ritenuta utilizzato in questo studio comprende una rete di ritenuta cilindrica, una copertura in tela, un tubo termico e un cuscinetto in schiuma stabilizzante. Posiziona il topo nella rete di contenzione, metti la rete di ritenuta nel tubo termico, quindi metti il tubo termico nella copertura in tela.
  3. Posizionare il cavo di segnale in una posizione adatta sotto il coperchio. Posiziona la coda del topo nell'apposita fessura del coperchio e fissala sul cuscinetto stabilizzante. Per le misurazioni è preferibile un ambiente non occupato, silenzioso e caldo. Spostare i ratti nel sito di misurazione con 20-30 minuti di anticipo in modo che possano adattarsi all'ambiente di misurazione.
    NOTA: I passaggi 2.2-2.3 possono essere eseguiti più volte per stabilizzare i ratti. Dopo diverse sessioni di allenamento, i ratti si abitueranno e potranno stabilizzarsi molto rapidamente, il che è conveniente per la successiva misurazione della pressione sanguigna.
  4. Collegare il collegamento del tubo dell'aria del sensore pressurizzato, il collegamento del segnale e il tubo di tenuta. Posizionare il sensore di pressurizzazione sulla punta della coda.
  5. Misurare la pressione sanguigna. Un'onda del polso appare dopo che la coda di topo è stata inserita nel sensore. Premere Start/Stop per avviare/arrestare la misurazione.
    NOTA: Il dispositivo determinerà automaticamente se la coda del topo è inserita nel sensore. Quando la coda del ratto non è inserita, il sensore di pressurizzazione non inizierà a pressurizzare e non effettuerà la misurazione.
  6. Al termine del test della pressione sanguigna, il menu Risultato verrà visualizzato automaticamente. Controllare il valore medio della misurazione, la deviazione standard (SD), l'errore standard (SE) e il coefficiente di variazione (CV) nel menu Risultati .
    NOTA: La pressione sanguigna di ciascun ratto è stata misurata tre volte, con un intervallo superiore a 2 minuti, ed è stato calcolato il valore medio.
  7. Dopo aver misurato la pressione sanguigna, sopprimere il ratto mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico al 2% in eccesso (100 mg/kg). Quindi, usando forbici chirurgiche e pinze dentate, seziona il ratto strato per strato dal perineo al collo. Capovolgere il contenuto toracico e addominale, navigare verso la biforcazione dell'aorta addominale tra i due reni e raccogliere l'aorta fino a una sezione dell'arco aortico.

3. Colorazione con ematossilina-eosina (HE)

  1. Fissare il tessuto vascolare aortico in paraformaldeide al 4% per almeno 24 ore.
  2. Prendi i campioni vascolari, disidratali in alcol a gradiente, rendili trasparenti in xilene e incorporali in paraffina.
  3. Dopo l'incorporazione, fare fette continue con uno spessore di 3-5 mm. Asciugare le fette a 60-70 °C, quindi conservarle a temperatura ambiente (RT).
  4. Decerare le sezioni immergendole in xilene I per 30 minuti, xilene II per 30 minuti, 100% alcol I per 10 minuti, 100% alcol II per 10 minuti, 95% alcol I per 5 minuti, 95% alcol II per 5 minuti, 80% alcol per 5 minuti, quindi risciacquare con acqua distillata.
  5. Macchiare le sezioni con ematossilina di Harris per 5 minuti e sciacquare in acqua di rubinetto per 5 minuti. Differenziare in alcool cloridrico all'1% per 10 s e risciacquare abbondantemente in acqua di rubinetto per 15 min. Lavare la sezione in acqua ammoniacale per 5 s e sciacquare abbondantemente in acqua di rubinetto per 15 minuti.
  6. Eseguire l'osservazione microscopica, colorare con eosina per 10 minuti e sciacquare abbondantemente in acqua di rubinetto per 15 minuti.
  7. Disidratare le sezioni immergendole in alcol etilico all'80% per 10 s, alcol 95% I per 5 min, alcol 95% II per 5 min, alcol 100% I per 10 min, alcol 100% II per 10 min, xilene I per 10 min e xilene II per 10 min.
  8. Sigillare le sezioni con gomma neutra.
  9. Osservare i cambiamenti istologici nei tessuti dell'aorta al microscopio ottico (obiettivo 100x, ingrandimento 1000x).

4. Colorazione tricromica di Masson

  1. Eseguire la deceratura di routine simile alla colorazione HE.
  2. Colorazione con ematossilina: Immergere i vetrini in una soluzione di ematossilina per 10 minuti, quindi risciacquare immediatamente con acqua di rubinetto.
  3. Immergere i vetrini in una soluzione di acido cloridrico all'1% per alcuni secondi, quindi risciacquare con acqua di rubinetto subito dopo.
  4. Immergere i vetrini nel colorante magenta acido Lichtenstein per 5 minuti e poi risciacquare con acqua.
  5. Immergere i vetrini in acido fosfomolibdico all'1% per 5 minuti.
  6. Immergere i vetrini in una colorazione blu all'anilina al 2% per 5 minuti e in una soluzione di lavaggio per immersione con acido acetico glaciale all'1% per 1 minuto. Quindi, lavare rapidamente i vetrini in alcol al 95% 3 volte.
  7. Eseguire la disidratazione di routine, la trasparenza e la sigillatura gengivale neutra in modo simile alla colorazione HE.

5. Misurazione dell'Hcy mediante ELISA

  1. Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico al 2% (45 mg/kg) e confermare la profondità dell'anestesia con un pizzico di dita. Afferra il topo e taglia i baffi per evitare il contatto durante il prelievo di sangue. Rimuovere i bulbi oculari del ratto con una pinza curva e raccogliere il sangue nelle provette sterili per microcentrifuga preparate. E poi, sopprimere il ratto con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital di sodio al 2% in eccesso (100 mg/kg).
  2. Lasciare coagulare naturalmente il sangue per 10-20 minuti a RT, quindi centrifugare (626-1409 x g) il sangue per circa 20 minuti a 2-8 °C.
  3. Raccogliere con cura il surnatante e conservarlo in frigorifero a -80 °C.
  4. Diluire lo standard nella provetta secondo le istruzioni del kit.
  5. Impostare i pozzetti in bianco (non vengono aggiunti campioni e reagenti enzimatici ai pozzetti di controllo in bianco; il resto delle fasi è lo stesso), i pozzetti standard e i pozzetti per campioni da testare. Aggiungere 50 μl di standard nella piastra, 40 μl di soluzione di diluizione del campione nei pozzetti del campione e quindi 10 μl di siero (la diluizione finale del campione è di 5 volte).
    NOTA: Aggiungere il campione sul fondo dei pozzetti della piastra; Cerca di non toccare le pareti dei pozzetti e agita delicatamente per mescolare.
  6. Sigillare la piastra con pellicola sigillante e incubare a 37 °C per 30 minuti.
  7. Diluire la soluzione di lavaggio concentrata 30 volte con acqua distillata e preparare per l'uso.
  8. Rimuovere con cura la pellicola sigillante, scartare il liquido e agitarlo per rimuovere tutto il liquido. Riempi ogni pozzetto con la soluzione di lavaggio, lascialo per 30 s e scartalo. Ripeti l'operazione 5 volte e picchiettalo per asciugarlo.
  9. Aggiungere 50 μl di reagente enzimatico a ciascun pozzetto, ad eccezione dei pozzetti vuoti.
  10. Utilizzare una pellicola sigillante per sigillare la piastra, quindi incubare a 37 °C per 30 minuti.
  11. Ripetere il passaggio 5.8.
  12. Aggiungere 50 μl di sviluppatore di colore A a ciascun pozzetto, quindi aggiungere 50 μl di sviluppatore di colore B e agitare delicatamente per mescolare bene. Incubare a 37 °C per 10 minuti in condizioni di scarsa illuminazione.
  13. Aggiungere 50 μl della soluzione di arresto a ciascun pozzetto per terminare la reazione (il colore blu diventerà giallo).
  14. Azzerare la reazione con pozzetti bianchi e misurare l'assorbanza (valore OD) di ciascun pozzetto in sequenza a 450 nm.
    NOTA: La misurazione deve essere eseguita entro 15 minuti dall'aggiunta della soluzione di arresto.

6. Estrazione dell'RNA e RT-PCR quantitativa

  1. Estrarre l'RNA totale.
    1. Tagliare rapidamente il tessuto aortico fresco alla dimensione appropriata (30-50 mg/pezzo) e macinare accuratamente in azoto liquido. Aggiungere 1 ml di reagente Trizol, mescolare bene e incubare con ghiaccio per 10 minuti per lisare il tessuto.
    2. Centrifugare a 2250 x g per 10 min a 4 °C. Trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga senza pellet.
    3. Aggiungere 200 μl di cloroformio, agitare energicamente per 15 s e incubare a RT per 5 minuti.
    4. Centrifugare a 2250 x g per 15 min a 4 °C. La miscela sarà divisa in tre strati: la fase organica fenolo-cloroformio inferiore, la fase intermedia e la fase acquosa superiore.
    5. Trasferire con cura la fase acquosa superiore in una nuova provetta per microcentrifuga (circa il 60% del volume di Trizol). Non aspirare la fase intermedia; Si può lasciare una piccola quantità di liquido superiore.
    6. Aggiungere un volume uguale di isopropanolo, mescolare delicatamente capovolgendo circa 10 volte e lasciare agire per 10 minuti a RT.
    7. Centrifugare a 2250 x g per 10 min a 4 °C. Scartare il surnatante e lavare due volte il precipitato di RNA con 1 mL di etanolo al 75%.
    8. Centrifugare a 2250 x g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e asciugare all'aria a RT per 5-10 minuti.
    9. Sciogliere l'RNA in 15-50 μL di acqua dietilpirocarbonato (DEPC) e controllare la concentrazione di RNA.
  2. Eseguire la trascrizione inversa e la RT-qPCR (Tabella 1)
    1. Rilevare l'espressione genica correlata allo stress del reticolo endoplasmatico (ERS) e all'apoptosi mediante qRT-PCR. Utilizzare l'RNA totale estratto al punto 6.1 e trascriverlo in cDNA utilizzando il kit di sintesi del cDNA secondo le istruzioni del produttore.
    2. Determinare l'espressione genica utilizzando un sistema di rilevamento PCR in tempo reale con una master mix SYBR Green PCR in un volume di reazione di 20 μL.
    3. Analizzare quantitativamente i dati con il metodo 2−ΔΔCTed esprimerli come differenza di n-volte rispetto all'espressione di β-actina. Gli inneschi sono mostrati nella Tabella 2.

7. Western blotting (WB)

  1. Estrarre le proteine totali dei tessuti.
    1. Posizionare una piccola quantità di blocco di tessuto nella parte sferica dell'omogeneizzatore da 1-2 ml e tagliare il blocco di tessuto il più possibile con le forbici pulite.
    2. Aggiungere 400 μl (w:v=1:10) del tampone di lisi RIPA e omogeneizzare. Quindi, mettilo sul ghiaccio. Dopo qualche minuto, macinare nuovamente e mettere sul ghiaccio. Ripetere il processo di macinazione più volte.
    3. Dopo 30 minuti di lisi, trasferire il lisato in una provetta da centrifuga da 1,5 mL con una pipetta e immergerla in una centrifuga a 4 °C preraffreddata. Centrifugare a 2250 x g per 10 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL.
  2. Quantifica la proteina.
    1. Diluire gli standard proteici secondo le istruzioni del kit. Ottenere gradienti di standard come segue: 0, 25, 125, 250, 500, 1000, 1500 e 2000 ng/μL.
    2. Prelevare 2,5 μl del campione proteico e diluirlo a 25 μl (10 volte) utilizzando il diluente del campione.
    3. Prelevare una piastra da 96 pozzetti e aggiungere 20 μl di campione proteico standard (in base al gradiente di concentrazione) e la proteina target ai pozzetti, rispettivamente due pozzetti per ogni campione di proteina target.
    4. Preparare la soluzione di sviluppo (pronta per l'uso) mescolando il liquido A e il liquido B nel rapporto di 50:1 e aggiungere 200 μl di soluzione di sviluppo a ciascun pozzetto.
    5. Posizionare la piastra a 96 pozzetti con l'aggiunta di campioni in un incubatore a 37 °C per 30 minuti.
    6. Rileva l'assorbanza a 562 nm.
    7. Calcolare la concentrazione di proteine da misurare.
      1. Prendi la concentrazione proteica standard come coordinata verticale e l'assorbanza a 562 nm come coordinata orizzontale per disegnare la curva standard.
      2. Calcolare la concentrazione della proteina bersaglio in base alla formula ottenuta dalla curva standard e all'assorbanza misurata della proteina bersaglio.
    8. Aggiungere 180 μl di tampone di caricamento a 20 μl di campione proteico in una provetta da microcentrifuga. Mettere la provetta da centrifuga in un bagno di metallo e denaturarla a 100 °C per 10 minuti. Utilizzare la proteina denaturata WB o conservarla a -20 °C.
  3. Eseguire l'immunoblotting.
    1. Configura il gel per elettroforesi delle proteine.
      1. Pulire e asciugare con il phon la lastra di vetro per colata di gel (1 mm o 1,5 mm) e fissarla sul dispositivo di colata in gel.
      2. Preparare il gel di separazione al 10% secondo la Tabella 3. Aggiungere il gel separatore configurato tra le lastre di vetro. Aggiungere lentamente la soluzione in gel per evitare la produzione di bolle d'aria. Quindi, aggiungere una quantità appropriata di etanolo anidro per appiattire la superficie del liquido del separatore. Lasciare agire in RT per 20-30 minuti fino a quando il gel non si sarà solidificato.
        NOTA: Maggiore è il peso molecolare, minore è la concentrazione di colla, in base alla necessità di formulare altre concentrazioni di colla separatore.
      3. Preparare il gel concentrato al 5% secondo la Tabella 3. Dopo la solidificazione del gel di separazione, versare lo strato superiore di etanolo anidro, riempire il gel concentrato e inserire lentamente il pettine di gel che si abbina alla lastra di vetro (fare attenzione a non avere bolle d'aria). Lasciare agire in RT per 20-30 minuti affinché il gel concentrato si solidifichi.
    2. Eseguire l'elettroforesi.
      1. Pesare 60,5 g di Tris, 375 g di glicina e 20 g di sodio dodecil solfato (SDS). Aggiungere l'acqua a 2 L, scaldare a 60 °C e mescolare per sciogliere fino a formare una soluzione di elettroforesi 10x. Lasciamo che la soluzione sia a RT; Diluirlo a 1 volta quando viene utilizzato.
      2. Rimuovere la lastra di vetro contenente la colla dal dispositivo di colata in gel, abbassare il pettine di colla nel flusso d'acqua a una velocità uniforme e, allo stesso tempo, scaricare le bolle d'aria nel foro di campionamento.
      3. Fissare la lastra di vetro nel serbatoio dell'elettroforesi e aggiungere la soluzione di elettroforesi 1x configurata. Assicurarsi che il serbatoio interno sia pieno e che il serbatoio esterno sia metà del serbatoio interno.
      4. Aggiungere la stessa massa di campione proteico e 5 μL di marcatore (utilizzato per indicare la dimensione delle proteine) nel pozzetto di aggiunta del campione.
      5. Far funzionare il gel a 60 V per 20 minuti, quindi a 100 V per 90 minuti fino a quando il tampone di caricamento non scorre sul fondo.
    3. Eseguire il trasferimento della membrana.
      1. Pesare 60 g di Tris e 288 g di glicina e aggiungere acqua a 2 L. Mescolare e sciogliere bene la soluzione per ottenere una soluzione di trasferimento a membrana 10x e riservare a RT. Diluire a un rapporto di 1:2:7 (10x soluzione transmembrana: metanolo: acqua) per ottenere 1x soluzione di lavoro.
        NOTA: La soluzione transmembrana deve essere preparata in anticipo e raffreddata a 4 °C in frigorifero.
      2. Immergere il PVDF in metanolo per un periodo di tempo appropriato (0,5-1 min) per attivare i gruppi caricati positivamente sulla membrana e facilitare il legame con le proteine caricate negativamente.
      3. Prendi la clip di trasferimento della membrana e fissala dopo aver posizionato i componenti in ordine (superficie nera-spugna-carta da filtro-gel per elettroforesi-membrana PVDF-carta da filtro-spugna-superficie bianca in sequenza).
        NOTA: Fare attenzione ad evitare bolle d'aria; Quando ci sono bolle d'aria, utilizzare il rullo per espellere le bolle d'aria.
      4. Posizionare la stecca nel serbatoio di trasferimento della membrana, prestare attenzione a seguire il corretto posizionamento dell'elettrodo, inserire due sacchetti di ghiaccio nel serbatoio e riempire con 1x liquido di trasferimento della membrana. Infine, immergere l'intera vasca transmembrana nel ghiaccio.
      5. Impostare le condizioni di trasferimento della membrana su 100 V per 1 ora.
        NOTA: Il tempo di trasferimento della membrana può essere regolato in base alle dimensioni della proteina; Minore è il peso molecolare della proteina, minore è il tempo di trasferimento della membrana.
    4. Eseguire il blocco.
      1. Per le proteine fosforilate, utilizzare il 5% di BSA (solvente TBST) come soluzione bloccante. Per le proteine non fosforilate, utilizzare latte scremato al 5% (solvente TBST) per il blocco.
      2. Versare la soluzione bloccante in un piatto di dimensioni adeguate. Inserire la membrana in PVDF nel piatto e assicurarsi che la membrana in PVDF sia immersa nella soluzione bloccante. Chiudere la capsula e incubare a RT per 1 ora.
      3. Rimuovere la membrana. In base al display del marcatore e alle dimensioni di ciascuna proteina bersaglio, tagliare la membrana nella dimensione appropriata ed etichettarla con i numeri di serie.
    5. Incubare l'anticorpo
      1. Rimuovere la soluzione bloccante e assorbire il liquido residuo con carta da filtro. Trasferire il PVDF tagliato corrispondente nelle diluizioni anticorpali corrispondenti (tra cui CPR78 [1:1000], TRAF2 [1:1000], p-JNK [1:1000], caspasi [1:1000] e GAPDH [1:1000]) e posizionarlo sull'agitatore rotante a 4 °C per una notte.
      2. Aggiungere 1x TBST e risciacquare a RT tre volte (10 min ciascuna).
      3. Incubare la membrana in PVDF nelle diluizioni anticorpali secondarie secondo le istruzioni del produttore e incubare a RT per 1 ora.
      4. Sciacquare la membrana aggiungendo 1x TBST a RT tre volte (10 min ciascuna).
    6. Sviluppare la membrana in PVDF.
      1. Mescolare volumi uguali di liquido A e liquido B nel kit di soluzione luminescente, agitare bene e preparare per l'uso.
      2. Posizionare la membrana in PVDF sulla pellicola trasparente per stenderla e aggiungere rapidamente e uniformemente l'agente luminescente preparato sulla membrana in modo rapido e uniforme. Incubare per 3 minuti a RT, evitando la luce.
      3. Rilevare le bande proteiche utilizzando i reagenti per il rilevamento del western blotting a chemiluminescenza potenziata (ECL).

8. Analisi dei dati

  1. Esprimi tutti i dati come media ± S.D. Esegui analisi statistiche tramite ANOVA unidirezionale utilizzando il software SPSS 20.0. Considera le differenze statisticamente significative quando p < 0,05.

Risultati

Come mostrato nella Tabella 4 e nella Tabella 5, la pressione arteriosa sistolica (SBP) e la pressione arteriosa diastolica (DBP) erano significativamente maggiori nel gruppo MET rispetto a quelle del gruppo CON da 1 a 4 settimane. Dopo il trattamento con HTJDTLD, la SBP e la DBP dei ratti erano significativamente inferiori a quelle del gruppo MET. In particolare, l'utilizzo combinato di HTJDTLD ed EM ha avuto un effetto antipertensivo più forte rispetto al solo trattamento con HTJDTLD....

Discussione

L'ipertensione è uno dei disturbi cardiovascolari più comuni che colpisce un terzo della popolazione adulta e aumenta il rischio di ictus, malattia coronarica e insufficienza cardiaca e renale8. L'ipertensione di tipo H è un tipo speciale di ipertensione che si riferisce alla co-occorrenza di ipertensione primaria e aumento dei livelli di omocisteina e ha attirato un'ampia attenzione nel corso degli anni9. Negli ultimi anni, l'uso di EM orali combinato con farmaci antipe...

Divulgazioni

Dichiariamo che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi rapporto commerciale o finanziario che possa essere interpretato come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Provincia di Jilin (n. YDZJ202301ZYTS189).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCRYeasen,China11149EScDNA synthesis kit 
Anti-beta-actin antibodyBioss, Chinabs-0061R
Anti-caspase-3 antibodyBioss, Chinabs-0081R
Anti-GPR78 antibodyAbcam, USAab108513
Anti-JNK antibodyAbcam, USAab76572
Anti-p-JNK antibodyBioss, Chinabsm-52462R
Anti-rabbit IgG antibodyBioss, Chinabs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 antibodyBioss, Chinabs-22372R
Bio-Rad CFX96 Touch system Bio-RadCFX96real-time PCR detection system 
ECL Western Blot SubstratesMerck, MA, USAWBULP-10ML
Enalapril maleate folic acid tabletsYangzijiang Pharmaceutical Company, China20040991
FastStart SYBR Green MasterSigmaFSSGMMRO
Fructus TrichosanthisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
HirudoThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
intelligent noninvasive sphygmomanometer Beijing Softron Biotechnology companyBP-2010A
Lonicerae Japonicae FlosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
MethionineSigma, USAM9500
Radix Angelicae SinensisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma GlycyrrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma NardostachyosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Rhodiolae CrenulataeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Salviae MiltiorrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix ScrophulariaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Rat Hcy ELISA KitsShanghai Meimian Industrial Company, ChinaMM-0293R2
RIPA bufferShanghai Beyotime Biotechnology companyP0013B

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