細胞質内精子注入後のマウス仔の血糖値のモニタリング

要約

ここでは、ICSIに起因する可能性のあるグルコース代謝の加齢に伴う変化を観察できるように、細胞質内精子注入(ICSI)-胚移植(ET)マウスを確立するためのプロトコルを提示します。

要約

人間の寿命はかなり長いですが、マウスモデルは比較的短期間で人間の全寿命をシミュレートでき、マウスの寿命の1年は人間の約40年に相当します。細胞質内精子注入法(ICSI)は、臨床現場で一般的に使用される生殖補助医療です。しかし、約30年前に登場した比較的最近のことを考えると、この技術が人類の発展に及ぼす長期的な影響は不明のままです。本研究では、マウスモデルを用いたICSIと胚移植(ET)を組み合わせた法を確立しました。その結果、正常なマウス精子は、 体外 培養とその後の顕微授精を受けた後、受精率89.57%、2細胞受精率87.38%を示しました。ET後、子孫の出生率は約42.50%でした。さらに、マウスの老化に伴い、グルコース代謝レベルの変動が観察されましたが、これはICSI技術の適用に関連している可能性があります。これらの知見は、マウスICSI-ET技術が、精子異常が胚発生に及ぼす影響や、特に糖代謝に関して、精子の異常が子孫の健康に及ぼす長期的な影響を評価するための貴重なプラットフォームを提供することを示しています。この研究は、ICSI技術が人間の発達に及ぼす潜在的な影響に関するさらなる研究に重要な洞察を提供し、この技術の長期的な影響についての詳細な調査の必要性を強調しています。

概要

不妊症の問題は、特に出生率の低下と不妊症の重症度の増加、有病率および重症度が目立つようになった現代社会において、医学的および社会学的な懸念の主要な焦点として浮上しています。生殖補助医療(ART)は、これらの課題に取り組むための幅広い可能性を提供し、細胞質内精子注入法(ICSI)は治療的介入として一般的に利用されています。

1992年にパレルモが細胞質内精子注入法(ICSI)による妊娠成功を初めて報告して以来、ICSIは生殖補助医療(^ART)1において極めて重要な技術となっています。しかし、ICSIが臨床現場で使用されてきたのはわずか30年と、人間の寿命に比べて比較的短い期間であることを考えると、ICSIの長期的な影響、特に子孫の発育への影響は広く調査および解明されていません。現在、遺伝的背景が均一で寿命が短いという特徴を持つマウスは、医学研究で広く利用されている代替モデルとして浮上しています。さらに、マウスモデルは、マウスの1年が人間の約40年に相当する圧縮された時間枠内で人間の全寿命を再現することができます²。

過去10年間で、いくつかの小規模な研究で、顕注によって妊娠した人は、人生の後半で異常な血糖値などのメタボリックシンドロームを発症するリスクが高くなる可能性があることが報告されています^3,4。エビデンスは決定的ではありませんが、この発見は、ICSIの長期的な健康への影響について、科学界内で深刻な懸念を引き起こしています。この状況は、ARTとその長期的な健康への影響について、より厳密な評価が急務であることを強調しています。特に、ヒト研究の限界と倫理的考慮に照らして、ICSI後のヒトの子孫の発達を正確に再現できる動物モデルの開発がますます重要になっています。このような状況において、マウスICSI-ET(Intracytoplasmic Sperm Injection-Embryo Transfer)モデルは、ヒトのICSIを模倣し、子孫の健康状態の長期モニタリングを容易にする能力があるため、ICSI技術^が子孫に及ぼす潜在的な健康リスクを評価するための効果的なツールとなっています5。

この研究は、ランダム血糖モニタリング、空腹時血糖検査、およびマウスのグルコース代謝状態を評価するための耐糖能試験を採用することにより、一般的な代謝表現型、すなわち子孫のグルコース代謝健康に対するICSI-ET技術の影響を調査することを目的としています。ランダムな血糖モニタリングは、正常な生理学的活動中のグルコース代謝の自然な変動を捉えるために利用されますが、空腹時血糖および耐糖能試験は、潜在的な糖尿病予備軍の状態を評価するために使用されます。

プロトコル

以下に説明するICSI-ETのプロトコルは、ガイドラインに従っており、上海家族計画研究所の研究の動物倫理レビューによって承認されています。安全手順:化学物質や生体材料を取り扱うときは、常に適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。フードの使用:認定されたヒュームフードまたはバイオセーフティキャビネット内で、揮発性化学物質またはエアロゾルの発生を含むすべての手順を実行します。雌マウス(6-8週齢のB6D2F1系統)を過剰排卵手順に使用します。

1. マウスのICSI

1. マウスの過剰排卵
   1. 初日の20:00頃に、妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン(PMSG)をマウスあたり7.5IUの用量で腹腔内注射します。
   2. 3日目の20:00頃(PMSG注射の48時間後)に、マウスあたり7.5IUの用量でヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)の腹腔内注射を投与します。
2. HTF培地を1 mLアリコートに調製し、雌マウスへのHCG注射の同日に5% CO₂ インキュベーターで37°Cで一晩平衡化するために蓋をせずに放置します。
3. ICSI受精液滴の調製
   1. 雌マウスへのHCG注射の同じ日に、50 x 9 mmの細胞培養皿の蓋を上半分と下半分に分けます。上半分を使用して、精子の配置に10%ポリビニルピロリドン(PVP)を使用して、それぞれ5μLの4〜6個の液滴を作成します。下半分を使用して、ICSI手順にM2培地を使用して、それぞれ5μLの8〜10個の液滴を作成します。
   2. PVPおよびM2中液滴を約3mLの鉱油で覆います(図1)。
4. 培養皿の準備
   1. 雌マウスへのHCG注射の同日に、35 x 10 mmの細胞培養皿に20 μLのKSOM培地(MR-020P-D)12滴を均等に分注します。液滴を約3mLの鉱油で覆います。
5. 精子採取:
   1. 4日目の午前9時00分頃(HCG注射の13時間後)に頚部脱臼により雄マウスを安楽死させます。
   2. 精巣上体尾部を分離し、滅菌ガーゼで優しく吸い取り、予め温めたHTF培地ですすいで、脂肪組織や血液の残りを取り除くために徹底的に洗浄します。
   3. 精子がHTF培地に自由に泳ぎ出せるように、尾精巣上体を切り開きます。鉗子を使用して尾部を静かに絞って精子を放出し、それらを事前に平衡化されたHTFチューブに集め、37°C、5%_CO2 インキュベーターでカバーを外して、精子の能力をさらに使用できるようにします。
6. 卵子の回収
   1. 子宮頸部脱臼による卵子回収を刺激された雌マウスを4日目の午前9時30分頃に安楽死させます。腹部の皮膚と筋肉層の正中線に沿って慎重に切開を行い、腹腔を露出させます。
   2. 細い鉗子を使用して、卵管の両側、特に膨らんだ膨大部から組織を穏やかに分離し、滅菌した培養皿でM2培地に移します。指定されたすべてのマウスから卵管が収集されるまで、この手順を繰り返します。
   3. 解剖顕微鏡下で、1 mLのシリンジ針を使用して、卵管の膨潤した膨大部の透明部分に穏やかに穴を開け、卵丘卵母細胞複合体(COC)の培地への放出を促進します。
   4. 同じシリンジを使用して、COCを慎重に選択し、100 μLの新鮮なM2培地を含む新しいディッシュに移します。すべてのCOCが元の卵管セグメントから正常に転送されるまで、この手順を繰り返します。
   5. 血液と組織液を拭き取り、解剖顕微鏡で卵管の膨大部を25Gの針で引き裂くと、多数のCOCが放出されます。
   6. 卵管と組織片を取り除き、COCをヒアルロニダーゼ(HY)を含むM2培地の液滴に移し、37°Cに予温します。
   7. 約5分間インキュベートした後、卵丘細胞と卵子の分離を容易にするために、穏やかなピペッティングを行います。中期II(MII)卵子をHY含有溶液から新鮮なM2培地に移します。その後、M2培地の複数の液滴に順次転写します。
   8. 2〜3ラウンドの洗浄後、卵子をKSOM培地の液滴に移し、37°C、5%_CO2 インキュベーターに保管してさらに使用します。
7. 4日目の午前10:00頃、容量のある精子の100μL(ステップ1.5.2を参照)を5秒間超音波処理し、46kHzの周波数で頭と尾を分離し、電力設定を50ワットにします。
   注:尾を切り詰めるために精子を超音波処理するときは、5秒を超えないように時間を制御するように注意してください。超音波処理の数秒後、精子を倒立顕微鏡で観察することができます。精子の約半分が切り捨てられた尾を示しているとき、超音波処理を停止します。
8. ICSIの手続き
   1. 注入には、先端がフラットで内径が6μmの市販のマイクロマニピュレーション針を使用し、25°の角度で注入します。針の内側に0.5cmの長さの充填部分で作動液を針に充填します。液体のレベルが~0.5cmに達することを確認してください。
      注:注入中は、受精卵子の生存率を低下させる可能性のある高温を避けるために、室温を19°Cに維持してください。液面が0.5cmに達する精度は、注入プロセスの完全性を維持し、卵子の生存率を確保するために重要です。
   2. マイクロマニピュレーターの右アームに注射針を取り付け、保持キャップを締めてしっかりと固定します。マイクロマニピュレーターの左腕にマウス卵子用に設計された市販の先端フラットチップマイクロマニピュレーション保持ピペットを取り付け、注射針と保持ピペットを顕微鏡の視野内に配置します。
   3. ピペットを使用して、1μLの超音波処理精子をPVP溶液の液滴に加えます。
   4. 20個のMII卵子をM2培地の液滴に入れます。
   5. 注射針を使用して、PVP溶液中の10〜20個の精子頭部を吸引します。次に、卵子を含む液滴に注射針を移動します。
   6. 偏光顕微鏡で卵子内の中期紡錘体の位置を直接決定し、紡錘体装置が注入側にないこと、極体は通常、卵子の向きに対して12時または6時の位置に位置していることを確認します。
   7. 卵子を培養皿の底に接触させてください。卵子の透明帯と注射針が同じ平面にくるように焦点面を調整します。
   8. 注射針が透明帯に接触したら、注射針にわずかな負圧を加え、透明帯の一部を引き込みます。.
   9. 強度設定を5、周波数を1のピエゾパルスを同時に活性化し、透明帯に効果的に穿孔を作成し、注射針が通過できるようにします。
   10. 注射針をペリビテリン腔に進め、精子の頭を針の先端に押し込みます。注射針を卵母細胞に挿入し、透明帯の反対側に到達するまで挿入します。
   11. 強度1、周波数1に設定されたピエゾパルスを使用して、原形質膜に小さな細孔を作り、PVPの侵入を最小限に抑え、卵子の完全性を最適に維持しながら精子頭部を卵形質に注入します。
   12. ステップ1.8.11を繰り返して、20個の卵子をすべて注入し、その後、19°Cで15分間インキュベートします。
   13. 生き残った卵子をKSOM培地に移し、インキュベーターに入れます。2細胞、4細胞、桑実胚、および胚盤胞の形成速度を観察します。
       注:卵子への細胞質内単一精子注入(ICSI)のタイミングは、HCGの注入後14〜18時間以内に手順を完了することを目指して、制御する必要があります。

2. マウス胚盤胞の子宮移植

1. 精管切除された雄マウスの調製
   注:研究には、6〜8週齢のICR雄マウスを使用してください。
   1. 体重 1.25 mL/10 g の投与量で 1.25% 2,2,2-トリブロモエタノールの腹腔内注射により麻酔を誘発します。痛みの反応がないことは、麻酔が成功したことを示しています。
      注:現在のプロトコルには、麻酔をかけた動物の目への獣医軟膏の塗布は含まれていませんが、目の乾燥を防ぎ、処置中の動物の健康と快適さを確保するためのベストプラクティスとして推奨されます。手術および回復プロセス全体を通じて、すべての手術器具は使用前に滅菌され、手術領域は消毒液を使用して準備され、清潔な操作環境を確保しました。
   2. 潜在的なストレスや怪我から保護するために、最初の回復段階で個別に手術を受けたマウスを飼育します。
   3. ブプレノルフィンを体重0.05 mg / kgの投与量で投与して、最適な痛みの緩和を確保します。.
      注:マウスの健康を確保するために、回復期間中はマウスを注意深く監視し、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまでマウスを放置しないでください。
   4. 精巣よりも優れた下腹部に手術部位を準備します。毛皮を取り除き、ポビドンヨードで消毒します。滅菌ハサミを使用して、alba線に沿って縦方向に1cmの切開を行います。無菌でほこりのない紙で血液をやさしく取り除き、白線に沿って腹筋を鈍く解剖し、腹腔にアクセスします。
   5. 湾曲した鉗子を使用して、左の精巣とそれに関連する脂肪パッドをそっとつかんで露出させます。輸精管を特定し、先のとがった鉗子を使用して慎重に分離し、操作用に10mmのセグメントを作成します。
   6. 湾曲した鉗子をアルコールランプの外炎に数秒間保持して滅菌します。輸精管をそっとつかみ、焼灼により輸精管が平らになり、白くなります。最初の焼灼ポイントから3〜5mm遠位に2番目の焼灼ポイントを作成します。滅菌外科用ハサミを使用して、2つの焼灼ポイント間の輸精管のセグメントを切り取ります。
   7. 輸精管の焼灼された端を注意深く検査し、短く、平らになり、白くなったセグメントが残っていることを確認します。湾曲した鉗子を使用して、精巣とそれに関連する脂肪パッドを腹腔にそっと戻します。
   8. 手順2.1.6で説明した手順を反対側(右側)で繰り返します。
   9. 縫合糸を使用して手術部位を閉じますが、通常は筋肉層に1針、皮膚に3針を配置します。外科的切開部の適切な位置合わせを確認し、ポビドンヨードで消毒します。動物を観察のために加熱パッドに移し、動物が意識を取り戻すまで10〜15分間監視します。回復したら、動物を飼育ケージに戻します。
      注:精管切除術後、マウスは14日間の回復期間を必要とし、その後1週間の試験交配実験が必要です。
   10. この週の間、精管切除された男性と女性を継続的に交配させ、交尾プラグを呈しているすべての女性の妊娠状態を観察します。交配の成功は、雌マウスの膣口に黄白色のブロック状の膣栓が存在することによって示されます。
       1. 初日の午後4時から午後6時の間にマウスをペアリングし、2日目の午前7時から午前9時の間に膣栓を確認します。膣プラグを装着した女性は、0.5日で偽妊娠状態にあると考え、その後の胚移植実験に使用します。膣栓のない女性をレシピエントグループに戻します。
          注:膣栓のないこれらの女性は、偽妊娠中の女性を準備するための交配に引き続き使用できます。すべての差し込まれた女性が妊娠しないようにしてください。そうして初めて、精管切除された男性を正式な実験に使用することができます。
       2. 精管切除されたオスは毎日交尾することができますが、交配セッションの間に1日の休息をとってください。
          注:私たちの経験に基づくと、精管切除された男性は1年以上にわたって高い交尾プラグ率を維持できます。ただし、交配中の女性で4〜6回連続して交尾プラグを生成できない精管切除された男性は、研究から削除する必要があります。
2. 偽妊娠女性の準備
   1. ICR雌マウス(生後7〜10週齢、体重25g以上)と精管切除した雄マウス(生後3〜6ヶ月)を1:1の比率で交配することにより、偽妊娠雌マウスを作製します。
      注:精管切除された雄は、雌マウスの子宮頸部を刺激するために使用され、その結果、黄体が活性化されました。
3. 胚盤胞を移すためのピペットの準備
   1. 移植する胚をインキュベーターから取り出し、37°Cの温度でM2培地の液滴に移します。
   2. トランスファーピペットを使用して、少量の液体を吸引し、少量の空気を吸い込み、6〜10個の胚を吸引します。最後に、別の少量の空気を吸引してピペットをシールします。
      注意: トランスファーピペット内の液体の長さは0.5cmを超えてはなりません。
4. 子宮移植(胚盤胞)
   1. 偽妊娠した雌マウス(交配後2.5日)の体重を量り、体重1.2 mL / 10 gの用量で1.25%2,2,2-トリブロモエタノールの腹腔内注射により麻酔をかけます。.鉗子で耳をやさしく押します。
   2. マウスに麻酔を投与し、アルコール消毒によって無菌を確保した後、腹側腹部に正中線縦切開を行います。緩んだ皮下組織を利用して、移植の必要に応じて切開部を左側または右側にずらします。小さなハサミを使用して、腰椎の外側~0.5cmで腹壁筋層の鈍的解剖を行い、腹腔にアクセスします。
   3. 非外傷性鉗子を使用して、卵巣、卵管、子宮を慎重に外部に形成します。
   4. 注射針の先端を使用して、血管を避けて、子宮卵管接合部の下の子宮壁に小さな上向きの角度の切開を行います。この切開は子宮腔へのアクセスを提供します。小さな穴に卵管を2〜3mm静かに挿入します。
   5. 胚のゆっくりとした注入中にトランスファーピペットを慎重に観察しながら、トランスファーピペットの端にある小さな気泡を慎重に排出します。培地の中央部分が排出されたことを確認したら、手順を停止し、トランスファーピペットを静かに取り外します。
   6. 卵巣、卵管、子宮を腹腔内に再配置します。筋肉層と皮膚を別々に縫合します。マウスが麻酔から回復するまで、マウスを加熱パッドの上に置きます。マウスの健康を確保するために、回復期間中はマウスを注意深く監視し、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまでマウスを放置しないでください。
5. 妊娠の観察
   1. 手術後、マウスを18〜21日間観察して、生まれた子孫の数を監視します。難産(難産)の場合は、帝王切開を行います。新生児マウスを同じ年齢層の授乳中の母マウスに育ててもらいます。

3.ランダム血糖値、空腹時血糖値、および耐糖能試験

1. マウスの成長中のランダムな血糖値の追跡
   1. マウスの誕生以来、餌と楽しみの良い夜の後の午前9時に4週間ごとにランダムな血糖値を監視します。
      1. マウスの尾の先端に穴を開けて、尾静脈の血液を採取します。
      2. 血液の最初の一滴は、それと混合された組織液の存在により、より高い糖測定値を有する。したがって、きれいな吸収紙を使用して血液の最初の一滴をやさしく拭きます。
      3. 尾静脈からの2滴目(~4μL)からハンドヘルドグルコメーターで血糖値を測定します。
2. マウス発生中の空腹時血糖値と耐糖能の変化の追跡
   注:最初の採血時点が15分であることを考慮すると、すべてのマウスは15分以内に注射する必要があります。各マウスの注入には20〜30秒かかるため、この時間枠内で注入が完了することを保証するために、各テストで使用できるマウスの最大数は30を超えることはできません。
   1. 空腹時血糖値と耐糖能試験は、生後4週間ごとに一晩絶食したマウスで実施します。
      1. 初日は、新鮮な照射された削りくずの寝具、清潔なケージ、蓋、水筒を準備します。マウスを餌のない新鮮なケージに移します。ケージに餌を与えないタグを追加します。
      2. 十分な10%グルコース注射(滅菌およびパイロジェンフリー)と1mLシリンジを準備します。.
      3. 各グループのマウスが1日目の午後5:00から2日目の午前9:00までの16時間絶食することを確認しますが、水への自由なアクセスを許可します。血糖値計を使用して、手順3.1.1.1-3.1.1.3で説明されている空腹時血糖値を測定します。
   2. マウスの体重を量り、尾に印を付けて、迅速な識別を容易にします。10 μL/gのマウス重量でグルコースシリンジを調製します。
   3. 30秒間隔で、10μL / gグルコースをマウスの腹腔内に注入します。.
      注:不正確な液体注入量を避けるために、ここでは注入技術に特別な注意を払う必要があります。操作の要点は次のとおりです。
      1. マウスを固定し、片手で尻尾を拘束します。腹腔内の臓器が頭に向かって移動し、十分な注射スペースが残るように、頭を臀部よりわずかに低く保ちます。
      2. 針を正中線と腰骨の間に置き、45度の角度で皮膚に挿入してから、針を皮膚表面と平行に0.5cm~0.5cm整列させながら、針を腹腔の奥深くまで優しく導きます。
         注:注射中の抵抗に注意を払い、内臓が誤って穴を開けたかどうかを判断してください。
      3. シリンジを腹腔内に排出します。
      4. インジェクションが開始された時間を記録し、タイマーを使用してインジェクションレートを制御します。タイマーの処理で時間を無駄にしないように、3 匹のマウスでタイマーを 90 秒に設定します。
   4. 尾静脈から希望の間隔(グルコース投与前の0、グルコース負荷の15、30、60、90、および120分)で血糖値を測定します。
      注:その後の血糖値検査も、マウスごとに20〜30秒かかる必要があります。
   5. 実験後、マウスを餌と水を備えた自宅のケージに戻します。

結果

当研究室では、マウスの精巣上体尾側精子を用いたICSIを用いて、受精率89.57%、2細胞受精率87.38%を達成しました。ET後の子孫の出生率は約42.50%です。驚くべきことに、すべての受精率、2細胞率、および子孫出生率は、ヒトARTで達成されるレベルに匹敵し、マウスでのヒトART技術のさまざまな段階の包括的なシミュレーションを可能にしました。詳細については、

ディスカッション

この研究では、マウスの細胞質内精子注入(ICSI)と胚移植(ET)技術を統合して、ヒト生殖補助医療(ART)を包括的に再現し、ETと組み合わせたICSIが子孫の発達に与える影響を調べました。正常なマウス精子に顕微授精法を適用したところ、高い受精率(86.76%)と2細胞率(88.48%)が得られました。ET後の仚マウスの出生率は約42.50%であり、技術プラットフォームの堅牢性を示して?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.25% avertin (2,2,2-tribromoethanol)	Nanjing Aibei	M2960	for anesthetization
Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile	BD	353001
Bacteriological Petri Dishes 50 x 9 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile	BD	351006
Biosafety Cabinet	ESCO	class BSC	Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc.
CO2 Incubator	Thermo	8000DH	Embryo culture
Dissection Microscope	Olympus	SZX16	Use in mouse embryo transfer
Fluorinert Fc-770	SIGMA	F3556	Fluorinert FC-770 is a thermally stable fully fluorinated liquid with high dielectric strength and resistivity, used as operating fluid
handheld glucometer	Roche	AccuChek performa	Blood glucose measurement
HTF	Merck	MR-070-D	The EmbryoMax Human Tubal Fluid (HTF) (1x), liquid designed for use with Mouse IVF is available in a 50 mL format and has been optimized and validated for Embryo Culture.
Hydraulic Microinjector	Eppendorf	CellTram 4r Oil, 5196000030	For sperm injection
Inverted Microscope	Nikon	TI2-U	Micromanipulation observation host
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Micromanipulator	NARISHIGE	NTX-N4	Micromanipulation arm
mineral oil	SIGMA	M8410	Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications.
Needle Cutter	Nanjing Aibei	Sutter MF-800	Use for fabricating micromanipulation needles
Needle Puller	Nanjing Aibei	Sutter model p-100	Use for making micromanipulation needles
Piezo Drill Trip Mouce ICSI	Eppendorf	5195000.087	Application of ICSI injection needle.
Piezoelectric Micromanipulator (Membrane Breaker)	Eppendorf	Eppendorf PiezoXpert	Use of micro-pulses to break the zona pellucida and oolemma of the oocyte
Pneumatic Microinjector	Eppendorf	CellTram 4r Air, 5196000013	For fixing the oocyte
Ready-to-use Human Chorionic Gonadotropin (Hcg)	Nanjing Aibei	M2520	Sterilization reagent, intraperitoneal injection. 50 IU/mL
Ready-to-use Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG)	Nanjing Aibei	M2620	Sterilization reagent, intraperitoneal injection. 50 IU/mL
Stereomicroscope	Olympus	SZX7	Oocyte retrieval and observation of embryo development