シェーグレン症候群原発性患者における口腔 カンジダ 感染の検討

要約

ここでは、原発性シェーグレン症候群の患者における口腔 カンジダ 感染症の検査のためのプロトコルを提示し、タイムリーな治療に使用でき、その後、関連する合併症を回避することができます。

要約

原発性シェーグレン症候群(pSS)は、口渇、ドライアイ、その他の全身症状などの症状を特徴とする自己免疫疾患です。pSS患者が経験する唾液分泌低下のために、口腔内細菌異化症がしばしば発生します。pSSの一般的な合併症は、口腔カンジダ感染症です。この記事では、著者らは、唾液、口腔粘膜スワブ、またはpSS患者のうがい薬を使用して、口腔カンジダ感染を効果的に診断し、カンジダ菌株を特定できる体系的な方法について説明します。サブローのデキストロース寒天培地(SDA)、菌糸形成アッセイ、水酸化カリウム(KOH)塗抹検査、およびカルコフルーオロホワイト(CFW)染色アッセイは、口腔カンジダ感染症の診断に使用されます。カンジダ菌株の同定には、カンジダ診断寒天が使用されます。最後に、抗真菌剤感受性試験を使用して、適切な抗真菌薬治療を決定します。この標準化された方法は、pSS関連の口腔カンジダ感染症の診断、治療、および将来の研究を強化することができます。この方法を使用した早期診断は、適切な治療を受けることの遅れによって生じる合併症を防ぐこともできます。

概要

カンジダ症は、日和見病原体であるカンジダ属によって引き起こされます。一般的な株には、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・パラプシロシス、およびカンジダ・ダブリニエンシス1が含まれます。カンジダ属によって引き起こされる日和見感染症には、表在性カンジダ感染症と侵襲性カンジダ症が含まれます。侵襲性カンジダ症は、主に免疫不全の人に発生します。たとえば、後天性免疫不全症候群(AIDS)の患者では、侵襲性カンジダ症は生活の質や寿命を著しく脅かす可能性があります²。粘膜皮膚カンジダ症などの表在性カンジダ感染症は、患者に多く見られます³。

表在性カンジダ感染症である口腔カンジダ症は、最も一般的なヒト真菌感染症です。カンジダ・アルビカンスは、口の正常な共生です。カンジダ属の保菌率は、症状のない一般集団で20%から75%の範囲であると報告されています⁴。カンジダの異常増殖は、感覚の味の変化、口の中の灼熱感、栄養不良による嚥下障害、回復の遅れ、入院期間の長期化など、患者に局所的な不快感を引き起こす可能性があります。長期の口腔カンジダ症は、重度の侵襲性カンジダ症を引き起こし、重大な罹患率と死亡率をもたらす可能性があります⁵。口腔カンジダ症も口腔がんのリスクを高める可能性があります⁵。唾液腺機能障害は、口腔カンジダ症の危険因子の1つです⁶。感染の開始は、カンジダの上皮細胞壁への付着です。これに続いて、カンジダの増殖とフィラメント化、バイオフィルムの形成と成熟^{が続きます7}。バイオフィルムは根絶が非常に困難であり、従来の抗真菌治療に耐性があるため、バイオフィルム関連の口腔カンジダ^感染症の臨床治療は困難です7。

原発性シェーグレン症候群(pSS)は、口渇、ドライアイ、およびその他の全身症状を特徴とする自己免疫疾患です⁸。口渇はpSSの最も頻繁な症状です。唾液には重要な生理学的抗真菌機能があります。一方では、口を希釈して精査し、その後粘膜から生物を除去することができます。一方、唾液には、ラクトフェリン、シアロペルオキシダーゼ、リゾチーム、ヒスチジンに富むポリペプチド、特異的抗カンジダ抗体などの抗菌タンパク質が含まれており、口腔粘膜と相互作用して カンジダ⁶の異常増殖を防ぐことができます。唾液の流れが減少すると、pSS患者が口腔カンジダ症にかかりやすくなる可能性があります。61人のpSS患者を対象に実施された観察横断研究では、pSS患者の13.1%がカンジダ症の口腔徴候を示し、 カンジダアルビカンスの コロニー形成単位(CFU)/ mLは、刺激されていない全唾液(UWS)および刺激された全唾液(SWS^{)のレベル}と有意かつ負の相関があることがわかりました9。

この原稿で紹介された方法は、直接塗抹標本中または培養後に、特徴付けられた形態学的属性(例えば、菌糸および酵母細胞)に基づいて口腔カンジダ感染を同定することができる¹⁰。カンジダ診断寒天を用いたカンジダの菌株同定は、種特異的酵素¹¹による発色基質の切断から生じる、さまざまな形態を持つ異なる色のコロニーの形成に基づいている。この原稿では、従来の口腔カンジダ培養、水酸化カリウム(KOH)塗抹検査およびカルコフルーオロホワイト(CFW)染色アッセイによる迅速検査など、経口カンジダ感染を検出するための体系的な方法を紹介します¹⁰。さらに、臨床的な経口カンジダ感染症治療を導くことができる抗真菌感受性試験が導入されました。実際の状況では、この原稿で紹介されている方法をすべて実行する必要はありません。経口カンジダ検出法は、目的に応じて選択することができます。口腔カンジダ感染症の検査と pSS 患者におけるカンジダ株の測定は、疾患の治療に役立つだけでなく、口腔カンジダ症の特徴と種プロファイルの評価にも役立ちます。

プロトコル

以下に説明するすべての手順は、首都医科大学北京天壇病院の倫理委員会 (番号 KY2023-177-01) によって承認され、この研究に関与するすべての患者がインフォームド コンセントを提供しました。

1.患者の包含基準と除外基準

1. 包含基準: 2016 年の米国リウマチ学会 (ACR)/欧州リウマチ学会 (EULAR) の基準¹² を満たしている場合、患者を pSS 患者として分類します。具体的には、最終的な分類基準は、抗SSA / Ro抗体陽性および限局性リンパ性唾液腺炎の5項目の加重合計に基づいており、フォーカススコアは≥1病巣/ 4 mm²で、各スコアは3です。異常な眼染色スコア ≥ 5 (または van Bijsterveld スコア ≥ 4)、シルマーの検査結果が ≤ 5 mm/5 分、刺激されていない唾液流量が ≤ 0.1 mL/分で、それぞれスコア 1。上記の項目の合計スコアが ≥ 4 の SS を示唆する徴候および/または症状のある個人は、pSS の基準を満たしています。
2. 除外基準:サンプル採取に協力できない患者と口腔 カンジダ 感染症の治療を受けている患者を除外します。
   注:以下に説明する方法は、二次SSを有する個人における口腔 カンジダ 感染症の包括的な特徴付けにも適していることに注意することが不可欠である。
3. カンジダサンプルの収集、輸送、培養中の潜在的な汚染を防ぐために、細心の注意を払ってください。これには、綿密な実験準備、使い捨ておよび滅菌材料の使用、適切なラベリング、サンプリングチューブの安全なシーリング、および専門的なバイオセーフティキャビネットでの実験手順の実施が含まれます。

2.サンプル収集

1. 唾液の収集:漏斗でチューブを持ち、唾液を下唇に沿ってチューブに徐々に流すように患者に指示します。収集の最後に、患者に口の中に残っているすべての唾液をチューブに吐き出すように依頼します。唾液を15分間採取します。
2. うがい薬と綿棒の採取:患者の刺激されていない唾液の流れがない、または極端に低い場合(0.03 mL / min未満)、口腔 カンジダ 感染が疑われる口腔粘膜領域を少なくとも10回綿棒で拭き取り、5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS; 材料の表を参照)を使用して1分間口をすすぐように患者に依頼します。うがい薬を50mLの滅菌チューブに保管し、綿棒をうがい薬チューブに入れます。.
   注:刺激されていない唾液の流れが0.03mL / minを超えるpSS患者の場合、ステップ2.2を使用して、経口 カンジダ 感染検出用のサンプルを収集できます。

3. サンプル処理

1. 採取した唾液にPBS1mLを加えます。PBSでうがい薬にPBSを追加しないでください。うがい薬チューブをボルテックスで1分間振動させます。

4. カンジダ 文化

1. サブーランド寒天培地(SDA)を作るには、70 gのSDA( 材料の表を参照)を1000 mLの二重蒸留水に溶解します。
2. オートクレーブで121°Cで15分間滅菌し、このSDA培地10 mLを10 cmの微生物学的培養皿( 材料の表を参照)にプレート付けし、冷却します。
3. ステップ3で調製したサンプル200μLを取り、ステップ4.2で10mLのSDA培地で調製した10cmの微生物培養皿にストリークします。
4. 37°Cで48時間インキュベートすると、 カンジダ コロニーが成熟します。 カンジダ コロニーを含むSDAディッシュを4°Cで一時的に保存します。 SDA皿で培養された カンジダ コロニーは、2〜4週間保存できます。

5. カンジダ 菌株の同定

1. 培地を作るには、 カンジダ 診断寒天( 材料表参照)粉末47.7gを取り出し、1000mLの再蒸留水に入れ、100°Cに加熱します。
2. 培地がわずかに沸騰したら、10 mLを10 cmの微生物培養皿にプレートし、冷まします。
3. カンジダコロニーを500 μLのSDA培地に溶解し(ステップ4)、ピペッティングで懸濁して解離します。
4. カンジダコロニーを含むサンプル50μL(ステップ5.3)を、ステップ5.2で調製した培地にプレートします。カンジダコロニーが成熟するまで、37°Cで48時間インキュベートします。
5. カンジダコロニーの色とパターンに従って、pSS患者から獲得したカンジダの株を決定します。次のカンジダ株の同定基準を使用します:エメラルドグリーンのコロニーはCandida albicans、青灰色のコロニーはCandida tropicalis、ぼやけたエッジを持つピンクのコロニー、および微絨毛はCandida krusei、紫がかった赤色の小さなコロニーはCandida glabrata、乳白色のコロニーにはCandida parapsilosisを含むいくつかの株が含まれています。

6. カンジダ バイオフィルム形成アッセイ

1. 酵母窒素塩基(YNB)-50グルコース(G)培地を作るには、1.34 g YNB( 材料の表を参照)と1.98 g D(+)-グルコース( 材料の表を参照)を秤量します。それらを200mLの二重蒸留水に溶かします。
2. YNB-100G培地を作るには、1.34gのYNBと3.96gのD(+)-グルコースを取り出し、200mLの二重蒸留水に溶かします。
3. 0.22 μmシリンジフィルターで溶液をろ過します( 材料の表を参照)。ろ過されたYNB-50GおよびYNB-100G培地は、4°Cで3ヶ月間保存することができる。
4. ステップ5でディッシュ上の同じ菌株から3つ(またはそれ以上)のコロニーを選び、それらを96ウェルプレート中の200μLのYNB-50G培地(ステップ6.1および6.3)に移します( 材料の表を参照)。皿で観察された株に対してこれを行います。200rpmで振とうしながら37°Cで一晩培養します。
5. カンジダ懸濁液を吸引し、PBS1 mLを加え、酵母細胞を1500 x gで室温で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。同じチューブでこの手順を2回繰り返します。
6. 細胞を1mLのYNB-100G培地に再懸濁し、異なる希釈液(1:10、1:100、および1:1000)の細胞を調製します。200 μLのグラジエントセル懸濁液を取り、スパイラルプレート法¹³により10 cm SDA培地にプレートします。めっきは、アルキメデススパイラルの形で回転する寒天プレートに既知の量のサンプルを減少し続ける量で堆積する機械を使用して行われます。37°Cで24〜48時間培養します。
7. 標準的な方法¹³に基づいて、SDAプレート中のCFUの数に応じて、異なる希釈液中の細胞の濃度を計算します。各プレートの十分に分離されたコロニーを簡単に数えます。少なくとも25個のコロニーが観察されるまで、外縁から中心に向かって1オクタントのコロニーを数えます。また、25^番目の カウントが発生したアークの残りの部分を数えます。コロニー数を、コロニー数が得られた面積に対応する液体量で割ることによって、細胞の濃度を計算する¹³。細胞の濃度を1 x 10⁷ 細胞/mLに調整します。
8. YNB-100G中の細胞懸濁液100μLを96ウェルプレートに入れ、200rpmで振とうしながら37°Cで2時間インキュベートします。
9. 上清を慎重に取り出し、PBSで2回洗い、浮遊酵母細胞を取り除きます。 カンジダ バイオフィルムは、96ウェルプレートの底部に形成されます。

7. 菌糸形成アッセイ

注:菌糸を形成できる カンジダ ( カンジダアルビカンスなど)のみが菌糸形成を誘導できます。ステップ8に進み、菌糸を形成できない カンジダ ( Candida glabrataなど)の詳細な特性評価を行います。

1. ステップ6.6で酵母細胞懸濁液を再懸濁し、YNB-100G培地で細胞濃度を1 x 10⁶ 細胞/mLに調整します。
2. RPMI 1640 完全増殖培地を調製するには、50 mL のウシ胎児血清( 材料表を参照)を 450 mL の RPMI 1640 培地( 材料表を参照)に加え、4 °C で保存してさらに実験します。
3. 200 μLのRPMI 1640完全増殖培地で希釈した カンジダ 細胞懸濁液2 μLを96ウェルプレートに移し、37°Cで一晩培養して、菌糸と酵母細胞を形成させます。

8. KOH塗抹試験およびCFW染色アッセイ

1. 精密成形ループ( 材料表を参照)を使用して、ステップ3、ステップ6、またはステップ7のサンプル1μLを取り出し、スライドガラスに1cm×1cmの領域を塗ります。室温で乾くのを待ちます。
2. 10%KOH溶液を作るには、10 gのKOH粉末( 材料の表を参照)を秤量し、100 mLの二重蒸留水に溶解します。
3. 試験片が溶解するまで、アルコールランプでスライドをわずかに加熱します。ステップ8.1で調製したスライドを10%KOH(ステップ8.2)で染色し、カバースリップで覆います。カバースリップを軽く押して、サンプルを透明にします。
4. 菌糸と酵母細胞を顕微鏡で可視化します。
5. ステップ8.1で調製したスライドをCFWを滴( 材料表を参照)で染色し、カバーガラスで覆い、1分間待ちます。
6. 蛍光顕微鏡を使用して100倍と200倍の倍率で菌糸を可視化し、CFWは355 nmで励起され、300-440 nmで検出されます。露光時間で画像を撮影します。誤検知の結果を避けるために、3回繰り返します。

9.抗真菌感受性試験

注:このテストは、酵母様真菌感受性キット(微量希釈; 材料の表を参照)の製造元の指示に従って実行されます。

1. 0.85%のNaClアンプル(材料の表を参照)で4日未満のカンジダコロニー(ステップ4)を準備し、2マクファーランドに相当する濁度を持つ懸濁液を入手します。McFarland Standards Kit (材料の表を参照) に従って濁度を決定します。準備したカンジダ懸濁液をすぐに使用してください。
2. 3 x 10⁴ 酵母細胞/mLを含むキット内のATB F2培地135 μLをテストストリップの各キュープルにピペットで移し、蓋をします。テストストリップを密閉容器に入れます。35°Cで24時間培養します。
3. カンジダの成長を視覚的に観察します(ユーザーマニュアルを参照)。参考値(参考範囲)については、取扱説明書を参照してください。コントロールホールが十分に成長しているか確認してください。コントロールホールの成長が不十分であるか、成長しない場合、結果を読み取ることができず、さらに24時間の培養が必要です。

結果

この研究では、pSS患者12例を代表患者として選択し、口腔カンジダ感染症のスクリーニングを行った(表1)。これらの患者の中には、口角炎(口角のひび割れ、落屑、充血を特徴とする、図1A)、歯肉粘膜の真っ赤な浮腫、黄白色の糸状の偽膜(図1B)、舌乳頭の萎縮、舌の真っ赤な背側粘膜(図1C)など、カンジ?...

ディスカッション

現在の原稿では、経口 カンジダ 感染症の検出、 カンジダ 株の同定、およびpSS患者における一般的に使用される薬剤の抗真菌感受性をテストするための一連の体系的で簡単で実行可能な方法を提供します。

実際の設定では、この原稿で紹介されているすべての方法が必要なわけではありません。経口 カンジダ 検出法は、特定の目的に基づいて選択?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filter	MERCK	SLGV004SL
1.5 mL Centrifuge Tube	axygen	MCT-150-C-S
10 cm Microbiological Culture Dishes	Jet Bio-Filtration Co. Ltd	TCD000100
15 mL Centrifuge Tube	Jet Bio-Filtration Co., Ltd	CFT011150
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430290
96-well Microplates	Corning	3599
API 0.85% NaCl ampule	BIOMERIEUX	20070
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
CHROMagar Candida	CHROMagar	P002860	Candida diagnostic agar
D(+)-Glucose Monohydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010518
Fetal Bovine Serum	Gibco	26170035
McFarland Standards Kit	BIOMERIEUX	70900
Nunc precision molded loops	ThermoFisher Scientific	254399
Phosphate Buffered Saline	Gibco	C10010500BT
Potassium Hydroxide	Aladdin	P112284-500g
PowerSoil DNA Isolation Kit	MO BIO	12888-50
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875119
Sabourand's Agar Medium	Solarbio	S9710
Yeast Nitrogen Base Without Amino acids	Solarbio	Y8040
Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution)	BIOMERIEUX	14204