Examen de l'infection orale à Candida chez les patients atteints du syndrome de Sjögren primitif

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour l’examen de l’infection orale à Candida chez les patients atteints du syndrome de Sjögren primitif, qui peut être utilisé pour un traitement rapide et, par la suite, pour éviter les complications associées.

Résumé

Le syndrome de Sjögren primaire (pSS) est une maladie auto-immune caractérisée par des symptômes tels que la bouche sèche, les yeux secs et d’autres symptômes systématiques. En raison de l’hyposalivation ressentie par les patients atteints de pSS, une dysbactériose buccale se produit souvent. Une complication fréquente du pSS est l’infection orale à Candida . Dans cet article, les auteurs décrivent des méthodes systématiques qui peuvent diagnostiquer efficacement l’infection orale à Candida et identifier les souches de Candida à l’aide de salive, d’écouvillons de la muqueuse buccale ou d’un rince-bouche de patients atteints de pSS. La gélose au dextrose de Sabouraud (SDA), le test de formation d’hyphes, le test de frottis à l’hydroxyde de potassium (KOH) et le test de coloration au blanc de calcofluor (CFW) sont utilisés pour le diagnostic de l’infection orale à Candida . Une gélose diagnostique de Candida est utilisée pour l’identification des souches de Candida . Enfin, les tests de sensibilité aux antifongiques sont utilisés pour déterminer le traitement médicamenteux antifongique approprié. Cette méthode standardisée peut améliorer le diagnostic, le traitement et la recherche future des infections orales à Candida liées au pSS. Un diagnostic précoce, à l’aide de cette méthode, peut également prévenir toute complication due à un retard dans l’obtention d’un traitement approprié.

Introduction

La candidose est causée par Candida spp., qui sont des agents pathogènes opportunistes. Les souches courantes comprennent Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis et Candida dubliniensis¹. Les infections opportunistes causées par Candida spp. comprennent les infections superficielles à Candida et la candidose invasive. La candidose invasive survient principalement chez les personnes immunodéprimées ; par exemple, chez les patients atteints du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), la candidose invasive peut menacer considérablement la qualité de vie ou même la durée de vie². L’infection superficielle à Candida , telle que la candidose cutanéo-muqueuse, est plus fréquente chez les patients³.

La candidose buccale, une infection superficielle à Candida , est l’infection fongique humaine la plus courante. Candida albicans est un commensal normal de la bouche ; le taux de portage de Candida spp. varie de 20 % à 75 % dans la population générale sans aucun symptôme⁴. La prolifération de Candida peut entraîner une gêne locale chez les patients, comme une altération du goût de la sensation, une sensation de brûlure dans la bouche, une dysphagie due à une mauvaise alimentation, une récupération retardée et un séjour prolongé à l’hôpital. La candidose buccale à long terme peut entraîner une candidose invasive sévère, entraînant une morbidité et une mortalité importantes⁵. La candidose buccale peut également augmenter le risque de cancer de la bouche⁵. L’altération de la fonction des glandes salivaires fait partie des facteurs de risque de candidose buccale⁶. L’initiation de l’infection est l’adhésion de Candida aux parois cellulaires épithéliales. S’ensuit la prolifération et la filamentation de Candida et la formation et la maturation du biofilm⁷. Les biofilms sont extrêmement difficiles à éradiquer et résistent aux traitements antifongiques conventionnels, ce qui rend le traitement clinique difficile pour l’infection orale à Candida associée au biofilm⁷.

Le syndrome de Sjögren primaire (pSS) est une maladie auto-immune caractérisée par une sécheresse de la bouche, des yeux secs et d’autres symptômes systématiques⁸. La sécheresse buccale est le symptôme le plus fréquent du pSS. La salive a d’importantes fonctions antifongiques physiologiques. D’une part, il peut diluer et récurer la bouche et ensuite éliminer les organismes de la muqueuse. D’autre part, la salive contient des protéines antimicrobiennes, telles que la lactoferrine, la sialoperoxydase, le lysozyme, des polypeptides riches en histidine et des anticorps anti-candidiques spécifiques, qui peuvent interagir avec la muqueuse buccale et empêcher la prolifération de Candida⁶. La réduction du flux salivaire peut prédisposer les patients atteints de pSS à la candidose buccale. Une étude transversale observationnelle menée auprès de 61 patients atteints de pSS a révélé que 13,1 % des patients atteints de pSS présentaient des signes buccaux de candidose et que la corrélation significative et négative entre l’unité formant une colonie (UFC)/mL de Candida albicans était significativement et négativement corrélée avec les niveaux de salive entière non stimulée (UWS) et de salive entière stimulée (SWS)⁹.

Les méthodes introduites dans ce manuscrit permettent d’identifier l’infection orale à Candida sur la base d’attributs morphologiques caractérisés (par exemple, les hyphes et les cellules de levure) lors d’un frottis direct ou après la culture¹⁰. L’identification de la souche de Candida à l’aide d’une gélose diagnostique Candida est basée sur la formation de colonies de différentes couleurs avec une morphologie variée, qui résultent du clivage des substrats chromogènes par des enzymes spécifiques à l’espèce¹¹. Dans ce manuscrit, des méthodes systématiques de détection de l’infection orale à Candida sont présentées, y compris la culture orale traditionnelle de Candida et l’examen rapide par frottis à l’hydroxyde de potassium (KOH) et au test de coloration au blanc de calcofluor (CFW)¹⁰. De plus, le test de sensibilité aux antifongiques, qui peut guider le traitement clinique de l’infection orale à Candida , a été introduit. Dans des situations réelles, il n’est pas nécessaire d’effectuer toutes les méthodes introduites dans ce manuscrit ; la ou les méthodes de détection orale de Candida peuvent être sélectionnées en fonction de l’objectif. L’examen de l’infection orale à Candida et la détermination des souches de Candida chez les patients atteints de pSS sont non seulement bénéfiques pour le traitement de la maladie, mais aident également à évaluer la caractérisation de la candidose buccale et les profils d’espèces.

Protocole

Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été approuvées par le comité d’éthique de l’hôpital Tiantan de Pékin, Université médicale de la capitale (NO. KY2023-177-01), et tous les patients impliqués dans cette étude ont fourni un consentement éclairé.

1. Critères d’inclusion et d’exclusion des patients

1. Critères d’inclusion : Classer les patients comme patients atteints de pSS s’ils répondent aux critères¹² de l’American College of Rheumatology (ACR) et de la Ligue européenne contre le rhumatisme (EULAR) de 2016. Plus précisément, baser les critères de classification finaux sur la somme pondérée de cinq éléments : positivité des anticorps anti-SSA/Ro et sialadénite lymphoïde focale avec un score de focalisation de ≥ 1 foyers/4 mm², chacun obtenant un score de 3 ; un score de coloration oculaire anormal de ≥ 5 (ou score de van Bijsterveld de ≥ 4), un résultat de test de Schirmer de ≤ 5 mm/5 min et un débit salivaire non stimulé de ≤ 0,1 mL/min, chacun obtenant un score de 1. Les personnes présentant des signes et/ou des symptômes évocateurs de SS qui ont un score total de ≥ 4 pour les éléments ci-dessus répondent aux critères de PSS.
2. Critères d’exclusion : Exclure les patients qui ne peuvent pas coopérer au prélèvement d’échantillons et les patients qui reçoivent un traitement pour une infection orale à Candida .
   REMARQUE : Il est essentiel de noter que les méthodes décrites ci-dessous conviennent également à la caractérisation complète des infections orales à Candida chez les personnes atteintes de SS secondaire.
3. Pour prévenir les contaminations potentielles pendant la collecte, le transport et la culture des échantillons de Candida , prenez des précautions méticuleuses. Cela comprend une préparation expérimentale méticuleuse, l’utilisation de matériaux à usage unique et stériles, un étiquetage approprié, le scellement sécurisé des tubes d’échantillonnage et la réalisation de procédures expérimentales dans une enceinte de biosécurité professionnelle.

2. Prélèvement d’échantillons

1. Prélèvement de salive : Demandez aux patients de tenir le tube avec un entonnoir et de laisser la salive s’écouler progressivement dans le tube le long de la lèvre inférieure. À la fin du prélèvement, demandez au patient de cracher toute la salive restante dans la bouche dans le tube. Recueillir la salive pendant 15 min.
2. Rince-bouche et prélèvement d’un écouvillon : Si le patient n’a pas de débit de salive non stimulé ou qu’il est extrêmement faible (moins de 0,03 mL/min), frottez au moins 10 fois la région de la muqueuse buccale suspectée d’être infectée par Candida buccale, puis demandez au patient d’utiliser 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; voir le tableau des matières) pour se rincer la bouche pendant 1 min. Conservez le rince-bouche dans un tube stérile de 50 ml et placez l’écouvillon dans le tube du rince-bouche.
   REMARQUE : Pour les patients atteints de pSS dont le débit salivaire non stimulé est supérieur à 0,03 mL/min, l’étape 2.2 peut toujours être utilisée pour prélever des échantillons pour la détection de l’infection orale à Candida .

3. Traitement des échantillons

1. Ajouter 1 mL de PBS à la salive recueillie. N’ajoutez pas de PBS dans le rince-bouche avec du PBS. Faites vibrer le tube du bain de bouche à l’aide d’un vortex pendant 1 min.

4. La culture du candida

1. Pour faire le milieu de la gélose de Sabourand (SDA), dissoudre 70 g de SDA (voir le tableau des matières) dans 1000 mL d’eau distillée doublement.
2. Stérile avec un autoclave à 121 °C pendant 15 min, mettre 10 mL de ce milieu SDA dans une boîte de culture microbiologique de 10 cm (voir le tableau des matériaux) et laisser refroidir.
3. Prendre 200 μL de l’échantillon préparé à l’étape 3 et l’étaler sur les boîtes de culture microbiologique de 10 cm préparées avec 10 mL de milieu SDA à l’étape 4.2.
4. Incuber pendant 48 h à 37 °C, et la colonie de Candida arrivera à maturité. Conservez temporairement la parabole SDA avec des colonies de Candida à 4 °C. Les colonies de Candida cultivées sur la parabole SDA peuvent être conservées pendant 2 à 4 semaines.

5. Identification de la souche de Candida

1. Pour fabriquer le milieu, prélevez 47,7 g de poudre de gélose diagnostique Candida (voir tableau des matériaux), mettez-la dans 1000 mL d’eau doublement distillée et chauffez-la à 100 °C.
2. Lorsque le milieu est légèrement bouillant, déposer 10 mL dans un plat de culture microbiologique de 10 cm et laisser refroidir.
3. Dissoudre les colonies de Candida dans 500 μL de milieu SDA (étape 4), suspendre et dissocier par pipetage.
4. Déposer sur une plaque 50 μL de l’échantillon contenant des colonies de Candida (étape 5.3) sur le milieu préparé à l’étape 5.2. Incuber pendant 48 h à 37 °C jusqu’à ce que les colonies de Candida soient matures.
5. Selon la couleur et les motifs des colonies de Candida , déterminez la ou les souches de Candida acquises chez les patients atteints de pSS. Utilisez les critères d’identification de la souche de Candida suivants : la colonie vert émeraude est Candida albicans, la colonie bleu-gris est Candida tropicalis, les colonies roses avec des bords flous et les microvillosités sont Candida krusei, la petite colonie rouge violacé est Candida glabrata, la colonie blanc laiteux contient plusieurs souches dont Candida parapsilosis.

6. Essai de formation du biofilm de Candida

1. Pour que la base d’azote de levure (YNB)-50 glucose (G) soit moyenne, pesez 1,34 g de YNB (voir le tableau des matériaux) et 1,98 g de D (+)-glucose (voir le tableau des matériaux). Dissoudre-les dans 200 mL d’eau distillée doublement.
2. Pour préparer le milieu YNB-100G, prélevez 1,34 g de YNB et 3,96 g de D(+)-glucose et dissolvez-les dans 200 ml d’eau distillée doublement.
3. Filtrez les solutions à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm (voir tableau des matériaux). Le milieu filtré YNB-50G et YNB-100G peut être stocké à 4 °C pendant 3 mois.
4. À l’étape 5, prélevez les 3 colonies (ou plus) de la même souche sur les plats et transférez-les dans 200 μL de milieu YNB-50G (étapes 6.1 et 6.3) dans une plaque à 96 puits (voir le tableau des matériaux). Faites-le pour les souches observées dans le plat. Culture pendant la nuit à 37 °C avec agitation à 200 tr/min.
5. Aspirez la suspension de Candida , ajoutez 1 mL de PBS, centrifugez les cellules de levure à 1500 x g pendant 5 min à température ambiante et jetez le surnageant. Répétez cette étape 2 fois dans le même tube.
6. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu YNB-100G et préparer différentes dilutions (1:10, 1:100 et 1:1000) des cellules. Prenez 200 μL de suspension à cellules dégradées et plaquez-les sur le milieu SDA de 10 cm par la méthode de la plaque en spirale¹³. Le placage est effectué à l’aide d’une machine qui dépose un volume connu d’échantillon sur une plaque de gélose rotative en quantité toujours décroissante sous la forme d’une spirale d’Archimède. Culture pendant 24-48 h à 37 °C.
7. Calculer la concentration des cellules dans différentes dilutions en fonction du nombre d’UFC dans la plaque SDA à l’aide d’une méthode standard¹³. Comptez brièvement les colonies bien séparées sur chaque assiette. Comptez les colonies en un seul octant du bord extérieur vers le centre jusqu’à ce qu’au moins 25 colonies soient observées. Comptez également le reste de cet arc où le 25^e décompte a eu lieu. Calculez la concentration des cellules en divisant le nombre de colonies par le volume de liquide correspondant à la zone sur laquelle le nombre de colonies a été obtenu¹³. Ajuster la concentration des cellules à 1 x 10⁷ cellules/mL.
8. Mettre 100 μL de suspension cellulaire dans YNB-100G dans une plaque à 96 puits et incuber à 37 °C pendant 2 h en agitant à 200 tr/min.
9. Retirez prudemment le surnageant, lavez-le 2 fois avec du PBS et éloignez les cellules de levure flottantes. Le biofilm de Candida se forme au fond de la plaque de 96 puits.

7. Essai de formation d’hyphes

REMARQUE : Seul le Candida qui peut former des hyphes (comme le Candida albicans) peut être induit pour la formation d’hyphes. Passez à l’étape 8 pour une caractérisation plus approfondie de Candida qui ne peut pas former d’hyphes (comme Candida glabrata).

1. Remettre en suspension la suspension de cellules de levure à l’étape 6.6 et ajuster la concentration cellulaire à 1 x 10⁶ cellules/mL avec le milieu YNB-100G.
2. Pour préparer le milieu de croissance complet RPMI 1640, ajouter 50 mL de sérum de veau fœtal (voir le tableau des matières) dans 450 mL de milieu RPMI 1640 (voir le tableau des matériaux) et conserver à 4 °C pour une expérience plus approfondie.
3. Transvaser 2 μL de suspension de cellules de Candida diluées dans 200 μL de milieu de croissance complet RPMI 1640 dans une plaque de 96 puits et cultiver pendant la nuit à 37 °C pour laisser les hyphes et les cellules de levure se former.

8. Test de frottis KOH et test de coloration CFW

1. Prélever 1 μL d’échantillons de l’étape 3, de l’étape 6 ou de l’étape 7 à l’aide d’une boucle moulée avec précision (voir le tableau des matériaux) et étaler une zone de 1 cm x 1 cm sur les lames de verre. Attendez qu’il sèche à température ambiante.
2. Pour préparer une solution de KOH à 10 %, pesez 10 g de poudre de KOH (voir le tableau des matériaux) et dissolvez-la dans 100 mL d’eau bidistillée.
3. Chauffez légèrement la lame avec une lampe à alcool jusqu’à ce que l’échantillon se dissolve. Teindre les lames préparées à l’étape 8.1 avec 10 % de KOH (étape 8.2) et couvrir avec un feuillet de couverture. Appuyez légèrement sur la lamelle pour rendre l’échantillon transparent.
4. Visualisez les hyphes et les cellules de levure au microscope.
5. Étalez les lames de teinture préparées à l’étape 8.1 avec une goutte de CFW (voir la Table des matériaux), recouvrez avec une lamelle et attendez 1 min.
6. Visualisez les hyphes à l’aide d’un microscope à fluorescence aux grossissements de 100x et 200x. CFW est excité à 355 nm et détecté à 300-440 nm. Photographiez les images sous le temps d’exposition. Répétez l’opération 3 fois pour éviter les faux positifs.

9. Test de sensibilité antifongique

REMARQUE : Cet essai est effectué conformément aux instructions du fabricant pour la trousse de sensibilité fongique de type levure (microdilution ; voir le tableau des matériaux).

1. Préparez les colonies de Candida (étape 4) de moins de 4 jours avec l’ampoule de NaCl à 0,85% (voir tableau des matériaux) et acquérez la suspension ayant la turbidité équivalente à 2 McFarland. Déterminez la turbidité selon le kit d’étalons McFarland (voir le tableau des matériaux). Utilisez la suspension Candida préparée instantanément.
2. Pipeter 135 μL de milieu ATB F2 dans le kit contenant 3 x 10⁴ cellules de levure/mL dans chaque cupule de la bandelette de test et mettre le couvercle. Mettez la bandelette de test dans un récipient scellé. Culture pendant 24 h à 35 °C.
3. Observez la croissance du Candida avec une interprétation visuelle (reportez-vous au manuel d’utilisation). Pour la valeur de référence (plage de référence), reportez-vous au manuel d’utilisation. Vérifiez si le trou de contrôle se développe correctement. Si la croissance du trou de contrôle est insuffisante ou ne se développe pas, les résultats ne peuvent pas être lus et nécessitent encore 24 heures de culture.

Résultats

Dans cette étude, 12 patients atteints de pSS ont été sélectionnés comme patients représentatifs et ont fait l’objet d’un dépistage de l’infection orale à Candida (tableau 1). Parmi ces patients, certains patients présentaient des lésions buccales typiques de l’infection à Candida , notamment une chéilite angulaire (caractérisée par des fissures aux coins de la bouche, une desquamation et une hyperémie, Figure 1A), un œdème rouge vi...

Discussion

Dans le présent manuscrit, nous fournissons une série de méthodes systématiques, simples et réalisables pour détecter les infections orales à Candida , identifier les souches de Candida et tester la sensibilité antifongique des médicaments couramment utilisés chez les patients atteints de pSS.

Dans des contextes pratiques, toutes les méthodes introduites dans ce manuscrit ne sont pas nécessaires. La ou les méthodes de détection orale de Candida peuvent...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filter	MERCK	SLGV004SL
1.5 mL Centrifuge Tube	axygen	MCT-150-C-S
10 cm Microbiological Culture Dishes	Jet Bio-Filtration Co. Ltd	TCD000100
15 mL Centrifuge Tube	Jet Bio-Filtration Co., Ltd	CFT011150
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430290
96-well Microplates	Corning	3599
API 0.85% NaCl ampule	BIOMERIEUX	20070
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
CHROMagar Candida	CHROMagar	P002860	Candida diagnostic agar
D(+)-Glucose Monohydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010518
Fetal Bovine Serum	Gibco	26170035
McFarland Standards Kit	BIOMERIEUX	70900
Nunc precision molded loops	ThermoFisher Scientific	254399
Phosphate Buffered Saline	Gibco	C10010500BT
Potassium Hydroxide	Aladdin	P112284-500g
PowerSoil DNA Isolation Kit	MO BIO	12888-50
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875119
Sabourand's Agar Medium	Solarbio	S9710
Yeast Nitrogen Base Without Amino acids	Solarbio	Y8040
Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution)	BIOMERIEUX	14204