Esame dell'infezione orale da Candida nei pazienti con sindrome di Sjögren primaria

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per l'esame dell'infezione orale da Candida in pazienti con sindrome di Sjögren primaria, che può essere utilizzato per un trattamento tempestivo e, successivamente, per evitare complicanze correlate.

Abstract

La sindrome di Sjögren primaria (pSS) è una malattia autoimmune caratterizzata da sintomi come secchezza delle fauci, secchezza oculare e altri sintomi sistematici. A causa dell'iposalivazione sperimentata dai pazienti con pSS, si verifica spesso disbatteriosi orale. Una complicanza comune della pSS è l'infezione orale da Candida . In questo articolo, gli autori descrivono metodi sistematici in grado di diagnosticare efficacemente l'infezione orale da Candida e identificare i ceppi di Candida utilizzando saliva, tamponi della mucosa orale o collutorio di pazienti con pSS. Il test di destrosio agar (SDA) di Sabouraud, il test di formazione ifale, il test dello striscio di idrossido di potassio (KOH) e il test di colorazione bianco calcofluor (CFW) sono utilizzati per la diagnosi di infezione orale da Candida . Un agar diagnostico per Candida viene utilizzato per l'identificazione dei ceppi di Candida . Infine, il test di suscettibilità antifungina viene utilizzato per determinare il trattamento farmacologico antimicotico appropriato. Questo metodo standardizzato può migliorare la diagnosi, il trattamento e la ricerca futura delle infezioni orali da Candida correlate a pSS. La diagnosi precoce, utilizzando questo metodo, può anche prevenire eventuali complicazioni dovute al ritardo nel ricevere un trattamento appropriato.

Introduzione

La candidosi è causata da Candida spp., che sono agenti patogeni opportunisti. I ceppi comuni includono Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis e Candida dubliniensis¹. Le infezioni opportunistiche causate da Candida spp. includono infezioni superficiali da Candida e candidosi invasiva. La candidosi invasiva si verifica principalmente in individui immunocompromessi; ad esempio, nei pazienti con sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), la candidosi invasiva può minacciare significativamente la qualità della vita o addirittura la durata della vita². L'infezione superficiale da Candida , come la candidosi mucocutanea, è più comune nei pazienti³.

La candidosi orale, un'infezione superficiale da Candida , è l'infezione fungina umana più comune. La Candida albicans è un normale commensale della bocca; è stato riportato che il tasso di trasporto di Candida spp. varia dal 20% al 75% nella popolazione generale senza alcun sintomo⁴. La crescita eccessiva di Candida può portare a disagio locale nei pazienti, come l'alterazione del gusto della sensazione, la sensazione di bruciore in bocca, la disfagia dovuta a cattiva alimentazione, il recupero ritardato e la degenza ospedaliera prolungata. La candidosi orale a lungo termine può portare a una grave candidosi invasiva, con conseguente significativa morbilità e mortalità⁵. La candidosi orale può anche aumentare il rischio di cancro orale⁵. La compromissione della funzione delle ghiandole salivari è tra i fattori di rischio per la candidosi orale⁶. L'inizio dell'infezione è l'adesione della Candida alle pareti cellulari epiteliali. Segue la proliferazione e la filamentazione della Candida e la formazione e maturazione del biofilm⁷. I biofilm sono estremamente difficili da eradicare e sono resistenti al trattamento antimicotico convenzionale, rendendo il trattamento clinico una sfida per l'infezione orale da Candida associata al biofilm⁷.

La sindrome di Sjögren primaria (pSS) è una malattia autoimmune caratterizzata da secchezza delle fauci, secchezza oculare e altri sintomi sistematici⁸. La secchezza delle fauci è il sintomo più frequente della pSS. La saliva ha importanti funzioni antimicotiche fisiologiche. Da un lato, può diluire e strofinare la bocca e successivamente rimuovere gli organismi dalla mucosa. D'altra parte, la saliva contiene proteine antimicrobiche, come lattoferrina, scialoperossidasi, lisozima, polipeptidi ricchi di istidina e anticorpi specifici anti-candida, che possono interagire con la mucosa orale e prevenire la crescita eccessiva di Candida⁶. Il ridotto flusso di saliva può predisporre i pazienti con pSS alla candidosi orale. Uno studio osservazionale trasversale condotto su 61 pazienti con pSS ha rilevato che il 13,1% dei pazienti con pSS presentava segni orali di candidosi e l'unità formante colonie (CFU)/mL di Candida albicans è risultata significativamente e negativamente correlata con i livelli di saliva intera non stimolata (UWS) e saliva intera stimolata (SWS)⁹.

I metodi introdotti in questo manoscritto possono identificare l'infezione orale da Candida in base ad attributi morfologici caratterizzati (ad esempio, le ife e le cellule di lievito) in striscio diretto o dopo coltura¹⁰. L'identificazione del ceppo della Candida utilizzando un agar diagnostico per Candida si basa sulla formazione di colonie di diversi colori con morfologia varia, che derivano dalla scissione dei substrati cromogenici da parte di enzimi specie-specifici¹¹. In questo manoscritto vengono introdotti metodi sistematici per rilevare l'infezione orale da Candida , tra cui la tradizionale coltura orale di Candida e l'esame rapido mediante striscio di idrossido di potassio (KOH) e test di colorazione calcofluor white (CFW)¹⁰. Inoltre, è stato introdotto il test di suscettibilità antifungina, che può guidare il trattamento clinico orale dell'infezione da Candida . In situazioni reali, non è necessario eseguire tutti i metodi introdotti in questo manoscritto; i metodi di rilevamento orale della Candida possono essere selezionati in base allo scopo. L'esame dell'infezione orale da Candida e la determinazione dei ceppi di Candida nei pazienti con pSS non solo avvantaggiano il trattamento della malattia, ma aiutano anche a valutare la caratterizzazione della candidosi orale e i profili delle specie.

Protocollo

Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate dal Comitato etico del Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University (NO. KY2023-177-01) e tutti i pazienti coinvolti in questo studio hanno fornito il consenso informato.

1. Criteri di inclusione ed esclusione del paziente

1. Criteri di inclusione: classificare i pazienti come pazienti con pSS se soddisfano i criteri 12 dell'American College of Rheumatology (ACR)/European League Against Rheumatism (EULAR)^{del 2016}. In particolare, basare i criteri di classificazione finale sulla somma ponderata di cinque elementi: positività agli anticorpi anti-SSA/Ro e scialoadenite linfatica focale con un punteggio di focus di ≥ 1 focolai/4 mm², ciascuno con un punteggio di 3; un punteggio di colorazione oculare anormale di ≥ 5 (o punteggio di van Bijsterveld di ≥ 4), un risultato del test di Schirmer di ≤ 5 mm/5 min e una velocità di flusso salivare non stimolata di ≤ 0,1 ml/min, ciascuno con un punteggio di 1. Gli individui con segni e/o sintomi suggestivi di SS che hanno un punteggio totale di ≥ 4 per gli elementi di cui sopra soddisfano i criteri per la pSS.
2. Criteri di esclusione: escludere i pazienti che non possono collaborare con la raccolta del campione e i pazienti che stanno ricevendo un trattamento per l'infezione orale da Candida .
   NOTA: È essenziale notare che i metodi descritti di seguito sono adatti anche per la caratterizzazione completa delle infezioni orali da Candida in individui con SS secondaria.
3. Per prevenire potenziali contaminazioni durante la raccolta, il trasporto e la coltura dei campioni di Candida , prendere precauzioni meticolose. Ciò include una meticolosa preparazione sperimentale, l'uso di materiali monouso e sterili, un'etichettatura adeguata, una sigillatura sicura delle provette di campionamento e l'esecuzione di procedure sperimentali in una cabina di biosicurezza professionale.

2. Raccolta del campione

1. Raccolta della saliva: Istruire i pazienti a tenere la provetta con un imbuto e lasciare che la saliva fluisca gradualmente nella provetta lungo il labbro inferiore. Al termine della raccolta, chiedere al paziente di sputare tutta la saliva rimanente in bocca nella provetta. Raccogli la saliva per 15 min.
2. Collutorio e raccolta di tamponi: se il paziente ha un flusso salivare non stimolato assente o estremamente basso (inferiore a 0,03 ml/min), tamponare l'area della mucosa orale con sospetta infezione orale da Candida almeno 10 volte, quindi chiedere al paziente di utilizzare 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; vedere Tabella dei materiali) per sciacquare la bocca per 1 minuto. Conservare il collutorio in una provetta sterile da 50 ml e inserire il tampone nella provetta del collutorio.
   NOTA: Per i pazienti con pSS con flusso salivare non stimolato superiore a 0,03 ml/min, la fase 2.2 può ancora essere utilizzata per raccogliere campioni per il rilevamento orale dell'infezione da Candida .

3. Elaborazione del campione

1. Aggiungere 1 ml di PBS alla saliva raccolta. Non aggiungere PBS nel collutorio con PBS. Vibrare il tubo del collutorio usando un vortice per 1 minuto.

4. Cultura della candida

1. Per rendere il terreno Sabourand's Agar (SDA), sciogliere 70 g di SDA (vedi Tabella dei materiali) in 1000 ml di acqua bidistillata.
2. Sterile in autoclave a 121 °C per 15 minuti, preparare 10 mL di questo terreno SDA in una piastra di coltura microbiologica da 10 cm (vedere la Tabella dei materiali) e raffreddare.
3. Prelevare 200 μl di campione preparato nella fase 3 e strizzarlo sulle piastre di coltura microbiologica da 10 cm preparate con 10 mL di terreno SDA nella fase 4.2.
4. Incubare per 48 ore a 37 °C e la colonia di Candida maturerà. Conservare temporaneamente la capsula SDA con colonie di Candida a 4 °C. Le colonie di Candida coltivate sul piatto SDA possono essere conservate per 2-4 settimane.

5. Identificazione del ceppo di Candida

1. Per preparare il terreno, prelevare 47,7 g di polvere di agar diagnostico per Candida (vedi Tabella dei materiali), metterla in 1000 ml di acqua distillata doppia e riscaldarla a 100 °C.
2. Quando il terreno è leggermente bollente, impiattare 10 ml in un piatto di coltura microbiologica di 10 cm e lasciare raffreddare.
3. Sciogliere le colonie di Candida in 500 μL di terreno SDA (fase 4), sospendere e dissociare mediante pipettaggio.
4. Preparare 50 μl del campione con colonie di Candida (fase 5.3) sul terreno preparato nella fase 5.2. Incubare per 48 ore a 37 °C fino a quando le colonie di Candida sono mature.
5. In base al colore e ai modelli delle colonie di Candida , determinare i ceppi della Candida acquisita da pazienti con pSS. Utilizzare i seguenti criteri di identificazione del ceppo di Candida : la colonia verde smeraldo è Candida albicans, la colonia grigio-blu è Candida tropicalis, le colonie rosa con bordi sfocati e microvilli sono Candida krusei, la piccola colonia rosso violaceo è Candida glabrata, la colonia bianco latte contiene diversi ceppi tra cui Candida parapsilosis.

6. Saggio di formazione del biofilm di Candida

1. Per rendere il terreno di base di azoto per lievito (YNB)-50 glucosio (G), pesare 1,34 g YNB (vedi Tabella dei materiali) e 1,98 g D (+)-glucosio (vedi Tabella dei materiali). Scioglierli in 200 ml di acqua distillata doppia.
2. Per rendere l'YNB-100G un mezzo, estrarre 1,34 g di YNB e 3,96 g di D (+)-glucosio e scioglierli in 200 ml di acqua distillata doppia.
3. Filtrare le soluzioni con un filtro per siringa da 0,22 μm (vedere la tabella dei materiali). Il terreno filtrato YNB-50G e YNB-100G può essere conservato a 4 °C per 3 mesi.
4. Prelevare le 3 (o più) colonie dallo stesso ceppo sulle piastre nella fase 5 e trasferirle in 200 μL di terreno YNB-50G (fasi 6.1 e 6.3) in una piastra a 96 pozzetti (vedere Tabella dei materiali). Fallo per le varietà osservate nel piatto. Coltura notturna a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
5. Aspirare la sospensione di Candida , aggiungere 1 mL di PBS, centrifugare le cellule di lievito a 1500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio 2 volte nella stessa provetta.
6. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno YNB-100G e preparare diverse diluizioni (1:10, 1:100 e 1:1000) di cellule. Prelevare 200 μl di sospensione cellulare a gradiente e piastrare sul terreno SDA da 10 cm con il metodo della piastra a spirale¹³. La placcatura viene eseguita utilizzando una macchina che deposita un volume noto di campione su una piastra di agar rotante in quantità sempre minore sotto forma di spirale di Archimede. Coltura per 24-48 ore a 37 °C.
7. Calcolare la concentrazione di cellule in diverse diluizioni in base al numero di CFU nella piastra SDA sulla base di un metodo standard¹³. Conta brevemente le colonie ben separate su ogni piatto. Contare le colonie in un ottante dal bordo esterno verso il centro fino a quando non si osservano almeno 25 colonie. Inoltre, conta il resto di quell'arco in cui si è verificato il 25^° conteggio. Calcolare la concentrazione delle cellule dividendo il conteggio delle colonie per il volume liquido corrispondente all'area su cui è stato ottenuto il conteggio delle colonie¹³. Regolare la concentrazione di cellule a 1 x 10⁷ cellule/mL.
8. Mettere 100 μl della sospensione cellulare in YNB-100G in una piastra a 96 pozzetti e incubare a 37 °C per 2 ore agitando a 200 giri/min.
9. Estrarre con cautela il surnatante, lavare 2 volte con PBS e rimuovere le cellule di lievito galleggianti. Il biofilm di Candida si forma sul fondo della piastra a 96 pozzetti.

7. Saggio di formazione ifa

NOTA: Solo la Candida che può formare ife (come la Candida albicans) può essere indotta per la formazione di ife. Vai al passaggio 8 per un'ulteriore caratterizzazione della Candida che non può formare ife (come la Candida glabrata).

1. Risospendere la sospensione di cellule di lievito al punto 6.6 e regolare la concentrazione cellulare a 1 x 10⁶ cellule/mL con terreno YNB-100G.
2. Per preparare il terreno di coltura completo RPMI 1640, aggiungere 50 ml di siero fetale bovino (vedere Tabella dei materiali) in 450 ml di terreno RPMI 1640 (vedere Tabella dei materiali) e conservare a 4 °C per ulteriori esperimenti.
3. Trasferire 2 μL di sospensione cellulare di Candida diluita in 200 μL di terreno di crescita completo RPMI 1640 in una piastra a 96 pozzetti e coltura per una notte a 37 °C per consentire la formazione delle ife e delle cellule di lievito.

8. Striscio di KOH e test di colorazione CFW

1. Prelevare 1 μL di campioni dalla fase 3 o dalla fase 6 o dalla fase 7 utilizzando un anello stampato di precisione (vedere la Tabella dei materiali) e spalmare un'area di 1 cm x 1 cm sui vetrini. Aspetta che si asciughi a temperatura ambiente.
2. Per ottenere una soluzione di KOH al 10%, pesare 10 g di polvere di KOH (vedere la Tabella dei materiali) e scioglierla in 100 mL di acqua bidistillata.
3. Riscaldare leggermente il vetrino con una lampada ad alcool fino a quando il campione non si dissolve. Colorare i vetrini preparati al punto 8.1 con KOH al 10% (passaggio 8.2) e coprire con un vetrino coprioggetto. Premere leggermente il vetrino coprioggetti per rendere trasparente il campione.
4. Visualizza le ife e le cellule di lievito al microscopio.
5. Colorare i vetrini preparati al punto 8.1 con una goccia di CFW (vedi Tabella dei materiali), coprire con un vetrino coprioggetti e attendere 1 min.
6. Visualizzare le ife utilizzando un microscopio a fluorescenza agli ingrandimenti di 100x e 200x. La CFW viene eccitata a 355 nm e rilevata a 300-440 nm. Fotografare le immagini con il tempo di esposizione. Ripetere 3 volte per evitare risultati falsi positivi.

9. Test di sensibilità antifungina

NOTA: Questo test viene eseguito secondo le istruzioni del produttore per il kit di suscettibilità fungina simile al lievito (microdiluizione; vedere la tabella dei materiali).

1. Preparare colonie di Candida (fase 4) di età inferiore a 4 giorni con l'ampolla di NaCl allo 0,85% (vedi Tabella dei materiali) e acquisire la sospensione avente la torbidità equivalente a 2 McFarland. Determinare la torbidità secondo il kit di standard McFarland (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare immediatamente la sospensione di Candida preparata.
2. Pipettare 135 μL di terreno ATB F2 nel kit contenente 3 x 10⁴ cellule di lievito/mL in ciascuna cupola della striscia reattiva e mettere il coperchio. Metti la striscia reattiva in un contenitore sigillato. Coltura per 24 ore a 35 °C.
3. Osservare la crescita della Candida con l'interpretazione visiva (fare riferimento al manuale d'uso). Per il valore di riferimento (intervallo di riferimento), fare riferimento al manuale dell'utente. Controllare se il foro di controllo sta crescendo adeguatamente. Se la crescita del foro di controllo è insufficiente o non cresce, i risultati non possono essere letti e necessitano di altre 24 ore di coltivazione.

Risultati

In questo studio, 12 pazienti con pSS sono stati selezionati come pazienti rappresentativi e sottoposti a screening per l'infezione orale da Candida (Tabella 1). Tra questi pazienti, alcuni pazienti presentavano lesioni orali tipiche dell'infezione da Candida , tra cui cheilite angolare (caratterizzata da crepe agli angoli della bocca, desquamazione e iperemia, Figura 1A), edema rosso vivo sulla mucosa gengivale, pseudomembrana filamentosa bianco-giallastra...

Discussione

Nel presente manoscritto, forniamo una serie di metodi sistematici, semplici e fattibili per rilevare le infezioni orali da Candida , identificare i ceppi di Candida e testare la suscettibilità antifungina dei farmaci comunemente usati nei pazienti con pSS.

In contesti pratici, non tutti i metodi introdotti in questo manoscritto sono necessari. I metodi di rilevamento orale della Candida possono essere scelti in base allo scopo specifico. I test di striscio KOH e i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filter	MERCK	SLGV004SL
1.5 mL Centrifuge Tube	axygen	MCT-150-C-S
10 cm Microbiological Culture Dishes	Jet Bio-Filtration Co. Ltd	TCD000100
15 mL Centrifuge Tube	Jet Bio-Filtration Co., Ltd	CFT011150
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430290
96-well Microplates	Corning	3599
API 0.85% NaCl ampule	BIOMERIEUX	20070
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
CHROMagar Candida	CHROMagar	P002860	Candida diagnostic agar
D(+)-Glucose Monohydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010518
Fetal Bovine Serum	Gibco	26170035
McFarland Standards Kit	BIOMERIEUX	70900
Nunc precision molded loops	ThermoFisher Scientific	254399
Phosphate Buffered Saline	Gibco	C10010500BT
Potassium Hydroxide	Aladdin	P112284-500g
PowerSoil DNA Isolation Kit	MO BIO	12888-50
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875119
Sabourand's Agar Medium	Solarbio	S9710
Yeast Nitrogen Base Without Amino acids	Solarbio	Y8040
Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution)	BIOMERIEUX	14204