JoVE Logo

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол обследования кандидозной инфекции полости рта у пациентов с первичным синдромом Шегрена, который может быть использован для своевременного лечения и последующего предотвращения связанных с ним осложнений.

Аннотация

Первичный синдром Шегрена (pSS) — это аутоиммунное заболевание, характеризующееся такими симптомами, как сухость во рту, сухость глаз и другие систематические симптомы. Из-за гипосаливации, испытываемой пациентами с ПСС, часто возникает дисбактериоз полости рта. Распространенным осложнением ПСС является инфекция кандиды полости рта. В этой статье авторы описывают систематические методы, которые могут эффективно диагностировать кандидозную инфекцию полости рта и идентифицировать штаммы кандиды с помощью слюны, мазков слизистой оболочки полости рта или жидкости для полоскания рта у пациентов с ПСС. Для диагностики кандидозной инфекции полости рта используются агар декстрозы Сабуро (SDA), анализ образования гиф, мазок на гидроксид калия (KOH) и анализ окрашивания калькофтором белым (CFW). Диагностический агар Candida используется для идентификации штаммов Candida . Наконец, тестирование на чувствительность к противогрибковым препаратам используется для определения соответствующего противогрибкового лекарственного лечения. Этот стандартизированный метод может улучшить диагностику, лечение и будущие исследования кандидозных инфекций полости рта, связанных с псС. Ранняя диагностика с использованием этого метода также может предотвратить любые осложнения, возникающие из-за задержки в получении соответствующего лечения.

Введение

Кандидоз вызывается Candida spp., которые являются условно-патогенными микроорганизмами. Распространенные штаммы включают Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis и Candida dubliniensis1. Оппортунистические инфекции, вызванные Candida spp., включают поверхностные инфекции Candida и инвазивный кандидоз. Инвазивный кандидоз в основном встречается у людей с ослабленным иммунитетом; например, у пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) инвазивный кандидоз может значительно угрожать качеству жизни или даже продолжительностижизни2. Поверхностная кандидозная инфекция, такая как слизисто-кожный кандидоз, чаще встречается у пациентов3.

Кандидоз полости рта, поверхностная кандидозная инфекция, является наиболее распространенной грибковой инфекцией человека. Candida albicans — нормальный комменсал полости рта; сообщалось, что частота носительства Candida spp. колеблется от 20% до 75% в общей популяции без каких-либо симптомов4. Чрезмерный рост Candida может привести к местному дискомфорту у пациентов, такому как изменение вкуса чувствительности, жжение во рту, дисфагия из-за плохого питания, задержка выздоровления и длительное пребывание в больнице. Длительный кандидоз полости рта может привести к тяжелому инвазивному кандидозу, что приводит к значительной заболеваемости и смертности5. Кандидоз полости рта также может увеличить риск развития рака полости рта5. Нарушение функции слюнных желез является одним из факторов риска развития кандидоза полости рта6. Инициацией инфекции является адгезия Candida к стенкам клеток эпителия. За этим следует пролиферация и филаментация Candida , а также образование и созревание биопленки7. Биопленки чрезвычайно трудно искоренить, и они устойчивы к обычному противогрибковому лечению, что делает клиническое лечение проблемой для биопленкоассоциированной инфекции кандиды полости рта 7.

Первичный синдром Шегрена (pSS) — это аутоиммунное заболевание, которое характеризуется сухостью во рту, сухостью глаз и другими систематическими симптомами8. Сухость во рту является наиболее частым симптомом пСС. Слюна обладает важными физиологическими противогрибковыми функциями. С одной стороны, он может разбавлять и очищать ротовую полость, а затем удалять микроорганизмы со слизистой оболочки. С другой стороны, слюна содержит антимикробные белки, такие как лактоферрин, сиалопероксидаза, лизоцим, богатые гистидином полипептиды и специфические антикандидозные антитела, которые могут взаимодействовать со слизистой оболочкой полости рта и предотвращать чрезмерный рост Candida6. Снижение оттока слюны может предрасполагать пациентов с псс к кандидозу полости рта. Обсервационное перекрестное исследование, проведенное у 61 пациента с пСС, показало, что у 13,1% пациентов с ПС наблюдались оральные признаки кандидоза, а было обнаружено, что колониеобразующая единица (КОЕ)/мл Candida albicans значительно и отрицательно коррелирует с уровнями нестимулированной цельной слюны (UWS) и стимулированной цельной слюны (SWS)9.

Методы, представленные в этой рукописи, могут идентифицировать кандидозную инфекцию полости рта на основе характерных морфологических признаков (например, гиф и дрожжевых клеток) в прямом мазке или после культивирования10. Идентификация штамма Candida с помощью диагностического агара Candida основана на образовании разноцветных колоний с различной морфологией, которые возникают в результате расщепления хромогенных субстратов видоспецифичными ферментами11. В этой рукописи представлены систематические методы выявления кандидозной инфекции полости рта, включая традиционное бактериологическое исследование кандиды в полости рта и экспресс-исследование с помощью мазка на гидроксид калия (KOH) и теста на окрашивание калькофтором белым (CFW)10. Кроме того, был введен тест на чувствительность к противогрибковым препаратам, который может помочь в клиническом лечении кандидозной инфекции полости рта. В реальных ситуациях нет необходимости выполнять все методы, представленные в этой рукописи; пероральный метод (методы) обнаружения кандиды может быть выбран в соответствии с целью. Исследование кандидозной инфекции полости рта и определение штаммов Candida у пациентов с псс не только способствуют лечению заболевания, но и помогают оценить характеристику кандидоза полости рта и видовые профили.

протокол

Все процедуры, описанные ниже, были одобрены Этическим комитетом Пекинской больницы Тяньтань, Столичный медицинский университет (No KY2023-177-01), и все пациенты, участвующие в этом исследовании, дали информированное согласие.

1. Критерии включения и исключения пациентов

  1. Критерии включения: Классифицировать пациентов как пациентов с ПСС, если они соответствуют критериям Американского колледжа ревматологии (ACR)/Европейской лиги по борьбе с ревматизмом (EULAR) 2016 года12. В частности, основывать окончательные критерии классификации на взвешенной сумме пяти пунктов: положительный результат на антитела к SSA/Ro и фокальный лимфоцитарный сиаладенит с оценкой фокуса ≥ 1 очаг/4мм2, каждый из которых оценивается по 3 балла; аномальная оценка окрашивания глаз ≥ 5 (или оценка ван Бейстервельда ≥ 4), результат теста Ширмера ≤ 5 мм/5 мин и скорость потока слюны без стимуляции ≤ 0,1 мл/мин, каждый из которых оценивается по 1 баллу. Лица с признаками и/или симптомами, указывающими на СС, которые имеют общий балл ≥ 4 по вышеуказанным пунктам, соответствуют критериям pSS.
  2. Критерии исключения: исключить пациентов, которые не могут сотрудничать при сборе образцов, и пациентов, получающих лечение от кандидозной инфекции полости рта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что методы, описанные ниже, также подходят для всесторонней характеристики оральных инфекций Candida у лиц с вторичным СС.
  3. Чтобы предотвратить потенциальное загрязнение во время сбора, транспортировки и культивирования образцов Candida , примите тщательные меры предосторожности. Это включает в себя тщательную подготовку эксперимента, использование одноразовых и стерильных материалов, надлежащую маркировку, надежную герметизацию пробирок для отбора проб и проведение экспериментальных процедур в профессиональном шкафу биобезопасности.

2. Забор образцов

  1. Сбор слюны: Проинструктируйте пациентов держать трубку воронкой и позволять слюне постепенно стекать в трубку вдоль нижней губы. По окончании сбора попросите пациента выплюнуть всю оставшуюся во рту слюну в трубку. Собирайте слюну в течение 15 минут.
  2. Полоскание рта и взятие мазка: Если у пациента отсутствует или очень низкий нестимулированный поток слюны (менее 0,03 мл/мин), возьмите мазок со слизистой оболочки полости рта с подозрением на кандидозную инфекцию не менее 10 раз, затем попросите пациента использовать 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS; см. Таблицу материалов) для полоскания рта в течение 1 минуты. Храните жидкость для полоскания рта в стерильной пробирке объемом 50 мл и поместите тампон в пробирку для полоскания рта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для пациентов с ПСС с нестимулированным потоком слюны более 0,03 мл/мин шаг 2.2 все еще можно использовать для сбора образцов для выявления инфекции Candida полости рта.

3. Обработка образцов

  1. Добавьте 1 мл PBS в собранную слюну. Не добавляйте PBS в ополаскиватель для полости рта с PBS. Вибрируйте трубку для полоскания рта с помощью вихря в течение 1 минуты.

4. Кандидозная культура

  1. Для получения среды агара Сабуранда (SDA) растворите 70 г SDA (см. Таблицу материалов) в 1000 мл двойной дистиллированной воды.
  2. Стерильно с помощью автоклава при 121 °C в течение 15 мин, поместите 10 мл этой среды SDA в 10-сантиметровую чашку для микробиологических культур (см. Таблицу материалов) и охладите.
  3. Возьмите 200 мкл образца, приготовленного на этапе 3, и нанесите его на 10-сантиметровые чашки для микробиологических культур, приготовленные с использованием 10 мл среды SDA на этапе 4.2.
  4. Инкубируйте в течение 48 ч при 37 °C, и колония Candida созреет. Временно храните чашку АСД с колониями Candida при температуре 4 °C. Колонии Candida, культивируемые на чашке SDA, могут храниться в течение 2-4 недель.

5. Идентификация штамма Candida

  1. Для приготовления среды возьмите 47,7 г порошка диагностического агара Candida (см. Таблицу материалов), поместите его в 1000 мл дважды дистиллированной воды и нагрейте до 100 °C.
  2. Когда среда слегка закипит, поместите 10 мл в 10-сантиметровую чашку для микробиологических культур и дайте остыть.
  3. Растворите колонии Candida в 500 μл среды SDA (шаг 4), приостановите и диссоциируйте с помощью пипетирования.
  4. Поместите 50 мкл образца с колониями Candida (шаг 5.3) в среду, приготовленную на этапе 5.2. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C до тех пор, пока колонии Candida не созреют.
  5. По цвету и характеру колоний Candida определить штамм (штаммы) приобретенной Candida у пациентов с pSS. Используйте следующие критерии идентификации штаммов Candida : изумрудно-зеленая колония — Candida albicans, сине-серая колония — Candida tropicalis, розовые колонии с нечеткими краями и микроворсинки — Candida krusei, пурпурно-красная маленькая колония — Candida glabrata, молочно-белая колония содержит несколько штаммов, включая Candida parapsilosis.

6. Анализ образования биопленки Candida

  1. Чтобы получить среду с дрожжевым азотным основанием (YNB)-50 глюкозой (G), весьте 1,34 г YNB (см. Таблицу материалов) и 1,98 г D (+)-глюкозы (см. Таблицу материалов). Растворите их в 200 мл дважды дистиллированной воды.
  2. Чтобы приготовить среду YNB-100G, возьмите 1,34 г YNB и 3,96 г D(+)-глюкозы и растворите их в 200 мл дважды дистиллированной воды.
  3. Отфильтровать растворы с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм (см. Таблицу материалов). Фильтрованную среду YNB-50G и YNB-100G можно хранить при температуре 4 °C в течение 3 месяцев.
  4. Выберите 3 (или более) колонии одного штамма на чашках на шаге 5 и перенесите их в 200 μL среды YNB-50G (шаги 6.1 и 6.3) в 96-луночный планшет (см. Таблицу материалов). Сделайте это для штаммов, наблюдаемых в блюде. Культивирование в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
  5. Аспирируйте суспензию Candida , добавьте 1 мл PBS, центрифугируйте дрожжевые клетки при 1500 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг 2 раза в той же пробирке.
  6. Ресуспендируйте клетки в 1 мл среды YNB-100G и приготовьте различные разведения (1:10, 1:100 и 1:1000) клеток. Возьмите 200 мкл суспензии градиентных ячеек и нанесите его на 10-сантиметровую среду SDA методом спиральных пластин13. Покрытие производится с помощью машины, которая наносит известный объем образца на вращающуюся агаровую пластину в постоянно уменьшающемся количестве в виде спирали Архимеда. Культивирование в течение 24-48 ч при 37 °С.
  7. Рассчитать концентрацию клеток в различных разведениях в соответствии с количеством КОЕ в планшете SDA на основе стандартного метода13. Кратко подсчитайте хорошо разделенные колонии на каждой пластине. Подсчитайте колонии в одном октанте от внешнего края к центру, пока не будет обнаружено по крайней мере 25 колоний. Кроме того, посчитайте оставшуюся часть той дуги, где произошел25-й отсчет. Рассчитайте концентрацию клеток, разделив количество колоний на объем жидкости, соответствующий площади, на которой было получено количество колоний13. Отрегулируйте концентрацию клеток до 1 x 107 клеток/мл.
  8. Поместите 100 μл клеточной суспензии в YNB-100G в 96-луночный планшет и инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч, встряхивая при 200 об/мин.
  9. Осторожно выньте надосадочную жидкость, промойте 2 раза PBS и удалите плавающие дрожжевые клетки. Биопленка Candida образуется на дне 96-луночного планшета.

7. Анализ гифального образования

ПРИМЕЧАНИЕ: Только Candida , которая может образовывать гифы (например, Candida albicans), может быть индуцирована для образования гиф. Перейдите к шагу 8 для дальнейшей характеристики Candida , который не может образовывать гифы (например, Candida glabrata).

  1. Ресуспендируйте суспензию дрожжевых клеток на шаге 6.6 и отрегулируйте концентрацию клеток до 1 x 106 клеток/мл с помощью среды YNB-100G.
  2. Для приготовления питательной среды RPMI 1640 добавьте 50 мл фетальной сыворотки крупного рогатого скота (см. Таблицу материалов) в 450 мл среды RPMI 1640 (см. Таблицу материалов) и храните при температуре 4 °C для дальнейшего эксперимента.
  3. Перенесите 2 мкл клеточной суспензии Candida , разведенной в 200 мкл полной питательной среды RPMI 1640, в 96-луночный планшет и культивируйте в течение ночи при 37 °C, чтобы дать возможность сформироваться гифам и дрожжевым клеткам.

8. Тест мазка KOH и анализ окрашивания CFW

  1. Извлеките 1 μл образцов из этапа 3, шага 6 или шага 7 с помощью прецизионной формованной петли (см. Таблицу материалов) и намажьте область 1 см x 1 см на предметные стекла. Подождите, пока он высохнет при комнатной температуре.
  2. Для приготовления 10% раствора КОН взвесьте 10 г порошка КОН (см. Таблицу материалов) и растворите его в 100 мл дважды дистиллированной воды.
  3. Слегка нагрейте предметное стекло спиртовой лампой, пока образец не растворится. Закрасьте предметные стекла, приготовленные на шаге 8.1, 10% KOH (шаг 8.2) и накройте покровным стеклом. Слегка нажмите на крышку, чтобы образец стал прозрачным.
  4. Визуализируйте гифы и дрожжевые клетки под микроскопом.
  5. Заморочьте предметные стекла, приготовленные на шаге 8.1, каплей CFW (см. Таблицу материалов), накройте покровным стеклом и подождите 1 мин.
  6. Визуализируйте гифы с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении 100x и 200x. CFW возбуждается при 355 нм и регистрируется при 300-440 нм. Фотографируйте изображения под выдержкой. Повторите 3 раза, чтобы избежать ложноположительных результатов.

9. Тест на чувствительность к противогрибковым препаратам

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест проводится в соответствии с инструкциями производителя для набора для определения чувствительности к дрожжевым грибам (микроразведение; см. Таблицу материалов).

  1. Подготовьте колонии Candida (шаг 4) возрастом менее 4 дней с помощью ампулы 0,85% NaCl (см. Таблицу материалов) и получите суспензию, имеющую мутность, эквивалентную 2 Фарландам. Определите мутность по набору стандартов Макфарланда (см. Таблицу материалов). Приготовленную суспензию Кандида используйте мгновенно.
  2. Пипетку 135 мкл среды ATB F2 в наборе, содержащем 3 x 104 дрожжевых клеток/мл, в каждую чашку тест-полоски и накройте крышкой. Поместите тест-полоску в герметичный контейнер. Культивирование в течение 24 ч при 35 °C.
  3. Наблюдайте за ростом Candida с помощью визуальной интерпретации (см. инструкцию по эксплуатации). Эталонное значение (эталонный диапазон) см. в руководстве пользователя. Проверьте, достаточно ли растет контрольное отверстие. Если рост контрольного отверстия недостаточен или не растет, то результаты не могут быть прочитаны и требуется еще 24 ч культивации.

Результаты

В этом исследовании 12 пациентов с pSS были отобраны в качестве репрезентативных пациентов и прошли скрининг на оральную кандидозную инфекцию (Таблица 1). Среди этих пациентов у некоторых пациентов наблюдались типичные поражения полости рта, вызванные инфекцией Candida , в...

Обсуждение

В настоящей рукописи мы представляем ряд систематических, простых и осуществимых методов выявления инфекций Candida полости рта, идентификации штаммов Candida и тестирования чувствительности к противогрибковым препаратам у пациентов с pSS.

В практических условиях н?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (82201084), Китайским фондом постдокторантуры (2022M722232), Пекинским фондом постдокторских исследований (2023-ZZ-020), проектом Мяопу Пекинской больницы Тяньтань, Столичным медицинским университетом (2023MP10) и Общим исследовательским фондом, Советом по исследовательским грантам Гонконга (27111820 и 17116521).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Syringe FilterMERCKSLGV004SL
1.5 mL Centrifuge TubeaxygenMCT-150-C-S
10 cm Microbiological Culture DishesJet Bio-Filtration Co. LtdTCD000100
15 mL Centrifuge TubeJet Bio-Filtration Co., LtdCFT011150
50 mL Centrifuge TubeCorning430290
96-well MicroplatesCorning3599
API 0.85% NaCl ampuleBIOMERIEUX20070
Calcofluor White StainSigma-Aldrich18909-100ML-F
CHROMagar CandidaCHROMagarP002860Candida diagnostic agar
D(+)-Glucose MonohydrateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10010518
Fetal Bovine Serum Gibco26170035
McFarland Standards KitBIOMERIEUX70900
Nunc precision molded loops ThermoFisher Scientific254399
Phosphate Buffered SalineGibcoC10010500BT
Potassium HydroxideAladdinP112284-500g
PowerSoil DNA Isolation Kit MO BIO12888-50
RPMI 1640 MediumGibco11875119
Sabourand's Agar MediumSolarbioS9710
Yeast Nitrogen Base Without Amino acidsSolarbioY8040
Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution)BIOMERIEUX14204

Ссылки

  1. Wang, X., et al. Microbiota dysbiosis in primary Sjögren's syndrome and the ameliorative effect of hydroxychloroquine. Cell Rep. 40 (11), 111352 (2022).
  2. Humphrey, S. P., Williamson, R. T. A review of saliva: normal composition, flow, and function. J Prosthet Dent. 85 (2), 162-169 (2001).
  3. Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontol 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
  4. Vila, T., Rizk, A. M., Sultan, A. S., Jabra-Rizk, M. A. The power of saliva: Antimicrobial and beyond. PLoS Pathog. 15 (11), e1008058 (2019).
  5. Serrano, J., et al. Risk factors related to oral candidiasis in patients with primary Sjögren's syndrome. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 25 (5), e700-e705 (2020).
  6. Napeñas, J. J., Rouleau, T. S. Oral complications of Sjögren's syndrome. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 26 (1), 55-62 (2014).
  7. Mathews, S. A., Kurien, B. T., Scofield, R. H. Oral manifestations of Sjögren's syndrome. J Dent Res. 87 (4), 308-318 (2008).
  8. Leung, K. C. M., McMillan, A. S., Cheung, B. P. K., Leung, W. K. Sjögren's syndrome sufferers have increased oral yeast levels despite regular dental care. Oral Dis. 14 (2), 163-173 (2008).
  9. Lundstrom, I. M., Lindstrom, F. D. Subjective and clinical oral symptoms in patients with primary Sjögren's syndrome. Clin Exp Rheumatol. 13 (6), 725-731 (1995).
  10. Alam, M. Z., et al. Candida identification: a journey from conventional to molecular methods in medical mycology. World J Microbiol Biotechnol. 30 (5), 1437-1451 (2014).
  11. Bauters, T. G., Nelis, H. J. Comparison of chromogenic and fluorogenic membrane filtration methods for detection of four Candida species. J Clin Microbiol. 40 (5), 1838-1839 (2002).
  12. Soto-Rojas, A. E., Villa, A. R., Sifuentes-Osornio, J., Alarcón-Segovia, D., Kraus, A. Oral candidiasis and Sjögren's syndrome. J Rheumatol. 25 (5), 911-915 (1998).
  13. Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Appl Microbiol. 25 (2), 244-252 (1973).
  14. Biomerieux. ATB FUNGUS 3 Sensitivity test for yeast-like fungi. REF 14204. Biomerieux. , (2014).
  15. Zhang, L., et al. The widely used ATB FUNGUS 3 automated readings in China and its misleading high MICs of Candida spp. to Azoles: Challenges for developing countries' clinical microbiology labs. PLoS One. 9 (12), e114004 (2014).
  16. Hu, L., Zhou, P., Zhao, W., Hua, H., Yan, Z. Fluorescence staining vs. routine KOH smear for rapid diagnosis of oral candidiasis-A diagnostic test. Oral Dis. 26 (5), 941-947 (2020).
  17. Samaranayake, L. P. Candida krusei infections and fluconazole therapy. Hong Kong Med J. 3 (3), 312-314 (1997).
  18. Lee, Y., Puumala, E., Robbins, N., Cowen, L. E. Antifungal drug resistance: Molecular mechanisms in Candida albicans and beyond. Chem Rev. 121 (6), 3390-3411 (2021).
  19. Rihab, B., Lina, E. H., Noémie, S. T., Jean, S., Marjolaine, G. The experience of dry mouth and screening for Sjogren's syndrome by the dentist: patient-reported experiences. BMC Oral Health. 23 (1), 1010 (2023).
  20. Panpetch, W., et al. Oral Candida administration in a Clostridium difficile mouse model worsens disease severity but is attenuated by Bifidobacterium. PLoS One. 14 (1), e210798 (2019).
  21. Alwaily, E. R., Abood, M. S., Al Uobody, R. M. Diagnosis of oral candidiasis in patients under 12 years: 18S rRNA as a marker of molecular characterization of Candida tropicalis. Arch Razi Inst. 78 (1), 475-483 (2023).
  22. Chen, C. L., et al. Candida infection as an early sign of subsequent Sjögren's syndrome: A population-based matched cohort study. Front Med (Lausanne). 8, 796324 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены