Untersuchung der oralen Candida-Infektion bei Patienten mit primärem Sjögren-Syndrom

Zusammenfassung

Im Folgenden stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der oralen Candida-Infektion bei Patienten mit primärem Sjögren-Syndrom vor, das für eine rechtzeitige Behandlung und danach zur Vermeidung damit verbundener Komplikationen verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Das primäre Sjögren-Syndrom (pSS) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch Symptome wie Mundtrockenheit, trockene Augen und andere systematische Symptome gekennzeichnet ist. Aufgrund der Hyposalivation, die bei pSS-Patienten auftritt, tritt häufig eine orale Dysbakteriose auf. Eine häufige Komplikation der pSS ist die orale Candida-Infektion . In diesem Artikel beschreiben die Autoren systematische Methoden, mit denen eine orale Candida-Infektion effektiv diagnostiziert und die Candida-Stämme anhand von Speichel, Mundschleimhautabstrichen oder Mundwasser von pSS-Patienten identifiziert werden können. Der Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA), der Hyphenbildungs-Assay, der Kaliumhydroxid (KOH)-Abstrich und der Calcofluorweiß-Färbetest (CFW) werden für die Diagnose einer oralen Candida-Infektion verwendet. Ein Candida-Diagnoseagar wird zur Identifizierung von Candida-Stämmen verwendet. Schließlich werden Empfindlichkeitstests auf Antimykotika verwendet, um eine geeignete antimykotische medikamentöse Behandlung zu bestimmen. Diese standardisierte Methode kann die Diagnose, Behandlung und zukünftige Erforschung von pSS-bedingten oralen Candida-Infektionen verbessern. Eine frühzeitige Diagnose mit dieser Methode kann auch Komplikationen verhindern, die durch eine Verzögerung bei der angemessenen Behandlung entstehen.

Einleitung

Candidiasis wird durch Candida spp. verursacht, die opportunistische Erreger sind. Zu den häufigen Stämmen gehören Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis und Candida dubliniensis¹. Zu den opportunistischen Infektionen, die durch Candida spp. verursacht werden, gehören oberflächliche Candida-Infektionen und invasive Candidiasis. Invasive Candidiasis tritt hauptsächlich bei immungeschwächten Personen auf; So kann beispielsweise bei Patienten mit erworbenem Immunschwächesyndrom (AIDS) eine invasive Candidiasis die Lebensqualität oder sogar die Lebenserwartung erheblich gefährden². Oberflächliche Candida-Infektionen , wie z. B. mukokutane Candidiasis, treten häufiger bei Patienten^{auf 3}.

Die orale Candidiasis, eine oberflächliche Candida-Infektion , ist die häufigste Pilzinfektion beim Menschen. Candida albicans ist ein normaler Kommensal des Mundes; Es wurde berichtet, dass die Übertragungsrate von Candida spp. in der Allgemeinbevölkerung ohne Symptome zwischen 20 % und 75 % liegt⁴. Ein übermäßiges Wachstum von Candida kann bei Patienten zu lokalen Beschwerden führen, wie z. B. verändertem Empfinden, Brennen im Mund, Dysphagie aufgrund schlechter Ernährung, verzögerter Genesung und längerem Krankenhausaufenthalt. Eine langfristige orale Candidiasis kann zu einer schweren invasiven Candidiasis führen, die zu einer signifikanten Morbidität und Mortalität führt⁵. Orale Candidiasis kann auch das Risiko für Mundkrebs erhöhen⁵. Eine gestörte Speicheldrüsenfunktion gehört zu den Risikofaktoren für orale Candidiasis⁶. Der Beginn der Infektion ist die Adhäsion von Candida an den epithelialen Zellwänden. Es folgt die Proliferation und Filamentierung von Candida sowie die Bildung und Reifung des Biofilms⁷. Biofilme sind extrem schwer zu beseitigen und resistent gegen konventionelle antimykotische Behandlungen, was die klinische Behandlung zu einer Herausforderung für die Biofilm-assoziierte orale Candida-Infektion macht⁷.

Das primäre Sjögren-Syndrom (pSS) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch Mundtrockenheit, trockene Augen und andere systematische Symptome gekennzeichnet^{ist 8}. Mundtrockenheit ist das häufigste Symptom der pSS. Speichel hat wichtige physiologische antimykotische Funktionen. Einerseits kann es den Mund verdünnen und scheuern und danach Organismen aus der Schleimhaut entfernen. Auf der anderen Seite enthält der Speichel antimikrobielle Proteine wie Lactoferrin, Sialoperoxidase, Lysozym, Histidin-reiche Polypeptide und spezifische Anti-Candida-Antikörper, die mit der Mundschleimhaut interagieren und das übermäßige Wachstum von Candida^{verhindern können 6}. Der verminderte Speichelfluss kann pSS-Patienten für eine orale Candidiasis prädisponieren. Eine beobachtende Querschnittsstudie, die an 61 pSS-Patienten durchgeführt wurde, ergab, dass 13,1 % der pSS-Patienten orale Anzeichen einer Candidiasis aufwiesen und eine koloniebildende Einheit (KBE)/ml von Candida albicans signifikant und negativ mit dem Gehalt an unstimuliertem Ganzspeichel (UWS) und stimuliertem Ganzspeichel (SWS) korrelierte9.

Die in diesem Manuskript vorgestellten Methoden können eine orale Candida-Infektion anhand charakterisierter morphologischer Merkmale (z. B. Hyphen und Hefezellen) im direkten Abstrich oder nach Kultivierung¹⁰ identifizieren. Die Stammbestimmung der Candida mittels eines Candida-Diagnoseagars beruht auf der Bildung verschiedenfarbiger Kolonien mit unterschiedlicher Morphologie, die sich aus der Spaltung chromogener Substrate durch artspezifische Enzyme^{ergeben 11}. In diesem Manuskript werden systematische Methoden zum Nachweis einer oralen Candida-Infektion vorgestellt, einschließlich der traditionellen oralen Candida-Kultur und der Schnelluntersuchung durch Kaliumhydroxid (KOH)-Abstrich und Calcofluorweiß (CFW)-Färbeassay¹⁰. Darüber hinaus wurde der antimykotische Empfindlichkeitstest eingeführt, der die klinische Behandlung einer Candida-Infektion leiten kann. In der Praxis ist es nicht notwendig, alle in diesem Manuskript vorgestellten Methoden durchzuführen; Die orale Candida-Nachweismethode (n) kann je nach Verwendungszweck ausgewählt werden. Die Untersuchung der oralen Candida-Infektion und die Bestimmung von Candida-Stämmen bei pSS-Patienten kommen nicht nur der Krankheitsbehandlung zugute, sondern helfen auch bei der Beurteilung der Charakterisierung der oralen Candidiasis und der Speziesprofile.

Protokoll

Alle unten beschriebenen Verfahren wurden von der Ethikkommission des Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, genehmigt (NO. KY2023-177-01), und alle an dieser Studie beteiligten Patienten gaben ihre Einverständniserklärung.

1. Ein- und Ausschlusskriterien für Patienten

1. Einschlusskriterien: Klassifizieren Sie Patienten als pSS-Patienten, wenn sie die Kriterien des American College of Rheumatology (ACR)/European League Against Rheumatism (EULAR) von 2016 erfüllen¹². Konkret stützen sich die endgültigen Klassifikationskriterien auf die gewichtete Summe von fünf Items: Anti-SSA/Ro-Antikörperpositivität und fokale lymphozytäre Sialadenitis mit einem Fokus-Score von ≥ 1 Foci/4 mm² mit jeweils 3 Punkten; ein abnormaler Ocular Staining Score von ≥ 5 (oder van Bijsterveld Score von ≥ 4), ein Schirmer-Testergebnis von ≤ 5 mm/5 min und eine unstimulierte Speichelflussrate von ≤ 0,1 ml/min, jeweils mit 1 Punkt. Personen mit Anzeichen und/oder Symptomen, die auf SS hindeuten und eine Gesamtpunktzahl von ≥ 4 für die oben genannten Punkte aufweisen, erfüllen die Kriterien für pSS.
2. Ausschlusskriterien: Ausschluss von Patienten, die bei der Probenentnahme nicht kooperieren können, und Patienten, die wegen einer oralen Candida-Infektion behandelt werden.
   HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass die im Folgenden beschriebenen Methoden auch für die umfassende Charakterisierung von oralen Candida-Infektionen bei Personen mit sekundärer SS geeignet sind.
3. Um mögliche Kontaminationen während der Entnahme, des Transports und der Kultivierung von Candida-Proben zu vermeiden, sollten Sie sorgfältige Vorsichtsmaßnahmen treffen. Dazu gehören die sorgfältige Vorbereitung der Experimente, die Verwendung von Einweg- und sterilen Materialien, die ordnungsgemäße Kennzeichnung, die sichere Versiegelung der Probenahmeröhrchen und die Durchführung von experimentellen Verfahren in einer professionellen Biosicherheitswerkbank.

2. Probenentnahme

1. Speichelsammlung: Weisen Sie die Patienten an, den Schlauch mit einem Trichter zu halten und den Speichel entlang der Unterlippe allmählich in den Schlauch fließen zu lassen. Bitten Sie den Patienten am Ende der Entnahme, den gesamten restlichen Speichel im Mund in das Röhrchen zu spucken. Den Speichel 15 Minuten lang auffangen.
2. Mundspülung und Abstrichentnahme: Wenn der Patient keinen oder nur einen extrem geringen unstimulierten Speichelfluss (weniger als 0,03 ml/min) hat, tupfen Sie den Mundschleimhautbereich mit Verdacht auf eine orale Candida-Infektion mindestens 10x ab und bitten Sie den Patienten, 5 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; siehe Materialtabelle) zu verwenden, um den Mund 1 Minute lang zu spülen. Bewahren Sie die Mundspülung in einem sterilen 50-ml-Röhrchen auf und geben Sie den Tupfer in das Mundwasserröhrchen.
   HINWEIS: Bei pSS-Patienten mit einem unstimulierten Speichelfluss von mehr als 0,03 ml/min kann Schritt 2.2 weiterhin verwendet werden, um Proben für den Nachweis einer oralen Candida-Infektion zu entnehmen.

3. Probenverarbeitung

1. Geben Sie 1 ml PBS in den gesammelten Speichel. Geben Sie PBS nicht in die Mundspülung mit PBS. Vibrieren Sie den Mundwasserschlauch mit einem Wirbel für 1 min.

4. Candida-Kultur

1. Um das Sabourand-Agar (SDA)-Medium herzustellen, lösen Sie 70 g SDA (siehe Materialtabelle) in 1000 mL doppelt destilliertem Wasser auf.
2. Mit einem Autoklaven bei 121 °C für 15 min steril ernähren, 10 mL dieses SDA-Mediums in eine 10 cm mikrobiologische Kulturschale geben (siehe Materialtabelle) und abkühlen lassen.
3. Entnahme von 200 μl der in Schritt 3 vorbereiteten Probe und Streifen auf die 10 cm großen mikrobiologischen Kulturschalen, die in Schritt 4.2 mit 10 ml SDA-Medium vorbereitet wurden.
4. 48 Stunden bei 37 °C inkubieren, und die Candida-Kolonie reift. Die SDA-Schale mit Candida-Kolonien bei 4 °C vorübergehend lagern. Die Candida-Kolonien , die auf der SDA-Schale kultiviert werden, können 2-4 Wochen gelagert werden.

5. Identifizierung von Candida-Stämmen

1. Um das Medium herzustellen, nehmen Sie 47,7 g Candida-Diagnoseagar-Pulver (siehe Materialtabelle), geben Sie es in 1000 mL doppelt destilliertes Wasser und erhitzen Sie es auf 100 °C.
2. Wenn das Medium leicht siedet, 10 ml in eine 10 cm große mikrobiologische Kulturschale geben und abkühlen lassen.
3. Die Candida-Kolonien in 500 μl SDA-Medium auflösen (Schritt 4), suspendieren und durch Pipettieren dissoziieren.
4. 50 μl der Probe mit Candida-Kolonien (Schritt 5.3) auf das in Schritt 5.2 vorbereitete Medium auffüllen. 48 h bei 37 °C inkubieren, bis die Candida-Völker ausgewachsen sind.
5. Bestimmen Sie anhand der Farbe und der Muster der Candida-Kolonien den/die Stamm(e) der erworbenen Candida von pSS-Patienten. Verwenden Sie die folgenden Kriterien zur Identifizierung des Candida-Stammes : Die smaragdgrüne Kolonie ist Candida albicans, die blaugraue Kolonie ist Candida tropicalis, die rosa Kolonien mit unscharfen Rändern und Mikrovilli sind Candida krusei, die purpurrote kleine Kolonie ist Candida glabrata, die milchig-weiße Kolonie enthält mehrere Stämme, einschließlich Candida parapsilosis.

6. Assay zur Bildung von Candida-Biofilmen

1. Um die Hefestickstoffbasis (YNB)-50 Glukose (G) medium zu machen, wiegen Sie 1,34 g YNB (siehe Materialtabelle) und 1,98 g D (+)-Glukose (siehe Materialtabelle). Löse sie in 200 ml doppelt destilliertem Wasser auf.
2. Um das YNB-100G-Medium herzustellen, nehmen Sie 1,34 g YNB und 3,96 g D (+)-Glucose heraus und lösen Sie sie in 200 mL doppelt destilliertem Wasser auf.
3. Filtrieren Sie die Lösungen mit einem 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter (siehe Materialtabelle). Das gefilterte Medium YNB-50G und YNB-100G kann 3 Monate lang bei 4 °C gelagert werden.
4. Entnehmen Sie die 3 (oder mehr) Kolonien desselben Stammes auf den Schalen in Schritt 5 und geben Sie sie in 200 μl YNB-50G-Medium (Schritte 6.1 und 6.3) in eine 96-Well-Platte (siehe Materialtabelle). Tun Sie dies für die in der Schale beobachteten Stämme. Kultur über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 200 U/min.
5. Aspirieren Sie die Candida-Suspension , fügen Sie 1 ml PBS hinzu, zentrifugieren Sie die Hefezellen bei 1500 x g für 5 min bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x in der gleichen Tube.
6. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml YNB-100G-Medium und bereiten Sie verschiedene Verdünnungen (1:10, 1:100 und 1:1000) von Zellen vor. Nehmen Sie 200 μl Gradientenzellsuspension und plattieren Sie sie mit der Spiralplattenmethode¹³ auf das 10 cm SDA-Medium. Die Beschichtung erfolgt mit einer Maschine, die ein bekanntes Probenvolumen in immer geringerer Menge in Form einer Archimedes-Spirale auf eine rotierende Agarplatte aufträgt. Kultur für 24-48 h bei 37 °C.
7. Berechnen Sie die Konzentration der Zellen in verschiedenen Verdünnungen entsprechend der Anzahl der KBE in der SDA-Platte auf der Grundlage einer Standardmethode¹³. Zähle kurz die gut getrennten Völker auf jedem Teller. Zählen Sie die Völker in einem Oktanten vom äußeren Rand zur Mitte, bis mindestens 25 Völker beobachtet sind. Zählen Sie auch den Rest des Bogens, in dem die 25^. Zählung stattgefunden hat. Berechnen Sie die Konzentration der Zellen, indem Sie die Koloniezahl durch das Flüssigkeitsvolumen dividieren, das dem Bereich entspricht, über den die Koloniezahl ermittelt wurde¹³. Stellen Sie die Konzentration der Zellen auf 1 x 10⁷ Zellen/ml ein.
8. 100 μl der Zellsuspension in YNB-100G in eine 96-Well-Platte geben und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubieren, während bei 200 U/min geschüttelt wird.
9. Nehmen Sie vorsichtig den Überstand heraus, waschen Sie 2x mit PBS und entfernen Sie die schwimmenden Hefezellen. Der Candida-Biofilm bildet sich am unteren Rand der 96-Well-Platte.

7. Assay der Hyphenbildung

HINWEIS: Nur Candida , das Hyphen bilden kann (wie Candida albicans), kann zur Hyphenbildung induziert werden. Fahren Sie mit Schritt 8 fort, um eine weitere Charakterisierung von Candida zu erhalten, die keine Hyphen bilden können (z. B. Candida glabrata).

1. Resuspendieren Sie die Hefezellsuspension in Schritt 6.6 und stellen Sie die Zellkonzentration mit YNB-100G-Medium auf 1 x 10⁶ Zellen/ml ein.
2. Zur Herstellung des vollständigen Wachstumsmediums RPMI 1640 50 ml fötales Kälberserum (siehe Materialtabelle) in 450 ml RPMI 1640 Medium (siehe Materialtabelle) geben und für weitere Versuche bei 4 °C lagern.
3. 2 μl Candida-Zellsuspension , verdünnt in 200 μl RPMI 1640 vollständiges Wachstumsmedium, in eine 96-Well-Platte überführen und über Nacht bei 37 °C kultivieren, damit sich die Hyphen und Hefezellen bilden können.

8. KOH-Abstrich und CFW-Färbetest

1. Entnehmen Sie 1 μl Proben aus Schritt 3 oder Schritt 6 oder Schritt 7 mit einer präzisionsgeformten Schlaufe (siehe Materialtabelle) und schmieren Sie eine Fläche von 1 cm x 1 cm auf die Objektträger. Warten Sie, bis es bei Raumtemperatur getrocknet ist.
2. Um eine 10%ige KOH-Lösung herzustellen, wiegen Sie 10 g KOH-Pulver (siehe Materialtabelle) und lösen Sie es in 100 mL doppelt destilliertem Wasser auf.
3. Erhitzen Sie den Objektträger leicht mit einer Alkohollampe, bis sich die Probe aufgelöst hat. Die in Schritt 8.1 vorbereiteten Objektträger mit 10 % KOH (Schritt 8.2) beizen und mit einem Deckglas abdecken. Drücken Sie leicht auf das Deckglas, um die Probe transparent zu machen.
4. Visualisieren Sie die Hyphen und Hefezellen unter dem Mikroskop.
5. Die in Schritt 8.1 vorbereiteten Objektträger mit einem Tropfen CFW (siehe Materialtabelle) beizen, mit einem Deckglas abdecken und 1 Minute warten.
6. Visualisieren Sie die Hyphen mit einem Fluoreszenzmikroskop bei den Vergrößerungen von 100x und 200x. CFW wird bei 355 nm angeregt und bei 300-440 nm detektiert. Fotografieren Sie die Bilder unter der Belichtungszeit. Wiederholen Sie dies 3x, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden.

9. Antimykotischer Empfindlichkeitstest

HINWEIS: Dieser Test wird gemäß den Anweisungen des Herstellers für das Hefe-ähnliche Pilzempfindlichkeitskit (Mikroverdünnung; siehe Materialtabelle) durchgeführt.

1. Bereiten Sie Candida-Kolonien (Schritt 4), die weniger als 4 Tage alt sind, mit der 0,85%igen NaCl-Ampulle vor (siehe Materialtabelle) und erwerben Sie die Suspension mit einer Trübung, die 2 McFarland entspricht. Bestimmen Sie die Trübung gemäß dem McFarland Standards Kit (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie die vorbereitete Candida-Suspension sofort.
2. Pipettieren Sie 135 μl ATB F2-Medium aus dem Kit mit 3 x 10⁴ Hefezellen/ml in jede Tasse im Teststreifen und setzen Sie den Deckel auf. Legen Sie den Teststreifen in einen verschlossenen Behälter. Kultur für 24 h bei 35 °C.
3. Beobachten Sie das Wachstum der Candida mit visueller Interpretation (siehe Bedienungsanleitung). Den Referenzwert (Referenzbereich) finden Sie in der Bedienungsanleitung. Prüfen Sie, ob das Kontrollloch ausreichend wächst. Wenn das Wachstum des Kontrolllochs unzureichend ist oder nicht wächst, können die Ergebnisse nicht abgelesen werden und es müssen weitere 24 Stunden kultiviert werden.

Ergebnisse

In dieser Studie wurden 12 Patienten mit pSS als repräsentative Patienten ausgewählt und auf eine orale Candida-Infektion untersucht (Tabelle 1). Bei diesen Patienten zeigten einige Patienten typische orale Läsionen einer Candida-Infektion , einschließlich eckiger Cheilitis (gekennzeichnet durch Risse an den Mundwinkeln, Abschuppung und Hyperämie, Abbildung 1A), hellrotes Ödem auf der Zahnfleischschleimhaut, gelblich-weiße, fadenförmige Pseudomembra...

Diskussion

Im vorliegenden Manuskript stellen wir eine Reihe von systematischen, einfachen und praktikablen Methoden zum Nachweis oraler Candida-Infektionen , zur Identifizierung von Candida-Stämmen und zum Testen der antimykotischen Empfindlichkeit häufig verwendeter Arzneimittel bei Patienten mit pSS zur Verfügung.

In der Praxis sind nicht alle Methoden, die in dieser Handschrift vorgestellt werden, notwendig. Die orale(n) Candida-Nachweismethode (n) kann je nach Verwendu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filter	MERCK	SLGV004SL
1.5 mL Centrifuge Tube	axygen	MCT-150-C-S
10 cm Microbiological Culture Dishes	Jet Bio-Filtration Co. Ltd	TCD000100
15 mL Centrifuge Tube	Jet Bio-Filtration Co., Ltd	CFT011150
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430290
96-well Microplates	Corning	3599
API 0.85% NaCl ampule	BIOMERIEUX	20070
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
CHROMagar Candida	CHROMagar	P002860	Candida diagnostic agar
D(+)-Glucose Monohydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010518
Fetal Bovine Serum	Gibco	26170035
McFarland Standards Kit	BIOMERIEUX	70900
Nunc precision molded loops	ThermoFisher Scientific	254399
Phosphate Buffered Saline	Gibco	C10010500BT
Potassium Hydroxide	Aladdin	P112284-500g
PowerSoil DNA Isolation Kit	MO BIO	12888-50
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875119
Sabourand's Agar Medium	Solarbio	S9710
Yeast Nitrogen Base Without Amino acids	Solarbio	Y8040
Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution)	BIOMERIEUX	14204