Examen de la infección oral por Candida en pacientes con síndrome de Sjögren primario

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para el examen de la infección oral por Candida en pacientes con síndrome de Sjögren primario, que puede ser utilizado para el tratamiento oportuno y, posteriormente, evitar complicaciones relacionadas.

Resumen

El síndrome de Sjögren primario (ssp) es una enfermedad autoinmune caracterizada por síntomas como sequedad de boca, ojos secos y otros síntomas sistemáticos. Debido a la hiposalivación que experimentan los pacientes con SPp, a menudo se produce disbacteriosis oral. Una complicación común de la pSS es la infección oral por Candida . En este artículo, los autores describen métodos sistemáticos que pueden diagnosticar eficazmente la infección oral por Candida e identificar las cepas de Candida utilizando saliva, hisopos de la mucosa oral o enjuagues bucales de pacientes con pSS. El agar dextrosa de Sabouraud (SDA), el ensayo de formación de hifas, la prueba de frotis de hidróxido de potasio (KOH) y el ensayo de tinción con blanco de calcofluor (CFW) se utilizan para el diagnóstico de la infección oral por Candida . Se utiliza un agar diagnóstico de Candida para la identificación de cepas de Candida . Por último, las pruebas de susceptibilidad a los antifúngicos se utilizan para determinar el tratamiento farmacológico antifúngico adecuado. Este método estandarizado puede mejorar el diagnóstico, el tratamiento y la investigación futura de las infecciones orales por Candida relacionadas con pSS. El diagnóstico precoz, mediante este método, también puede prevenir las complicaciones que surjan debido a la demora en recibir el tratamiento adecuado.

Introducción

La candidiasis es causada por Candida spp., que son patógenos oportunistas. Las cepas comunes incluyen Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis y Candida dubliniensis¹. Las infecciones oportunistas causadas por Candida spp. incluyen infecciones superficiales por Candida y candidiasis invasiva. La candidiasis invasiva ocurre principalmente en individuos inmunocomprometidos; por ejemplo, en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la candidiasis invasiva puede amenazar significativamente la calidad de vida o incluso la esperanza de vida². La infección superficial por Candida , como la candidiasis mucocutánea, es más frecuente en los pacientes³.

La candidiasis oral, una infección superficial por Candida , es la infección fúngica humana más común. Candida albicans es un comensal normal de la boca; se ha reportado que la tasa de portación de Candida spp. oscila entre el 20% y el 75% en la población general sin ningún síntoma⁴. El crecimiento excesivo de Candida puede provocar molestias locales en los pacientes, como alteración del gusto de la sensación, sensación de ardor en la boca, disfagia debido a una mala nutrición, retraso en la recuperación y estancia hospitalaria prolongada. La candidiasis oral a largo plazo puede conducir a una candidiasis invasiva grave, lo que resulta en una morbilidad y mortalidad significativas⁵. La candidiasis oral también puede aumentar el riesgo de cáncer oral⁵. El deterioro de la función de las glándulas salivales es uno de los factores de riesgo para la candidiasis oral⁶. El inicio de la infección es la adhesión de Candida a las paredes celulares epiteliales. A esto le sigue la proliferación y filamentación de Candida y la formación y maduración de biofilm⁷. Las biopelículas son extremadamente difíciles de erradicar y son resistentes al tratamiento antifúngico convencional, lo que hace que el tratamiento clínico sea un desafío para la infección oral por Candida asociada a la biopelícula⁷.

El síndrome primario de Sjögren (SPS) es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por sequedad de boca, ojos secos y otros síntomas sistemáticos⁸. La sequedad bucal es el síntoma más frecuente del pSS. La saliva tiene importantes funciones fisiológicas antifúngicas. Por un lado, puede diluir y fregar la boca y, posteriormente, eliminar organismos de la mucosa. Por otro lado, la saliva contiene proteínas antimicrobianas, como la lactoferrina, la siaoperoxidasa, la lisozima, polipéptidos ricos en histidina y anticuerpos anticándidos específicos, que pueden interactuar con la mucosa oral y prevenir el crecimiento excesivo de Candida⁶. La reducción del flujo sanguíneo puede predisponer a los pacientes con pSS a la candidiasis oral. Un estudio observacional transversal realizado en 61 pacientes con pSS encontró que el 13,1% de los pacientes con pSS presentaron signos orales de candidiasis y se encontró una correlación significativa y negativa de la unidad formadora de colonias (UFC)/mL de Candida albicans con los niveles de saliva total no estimulada (UWS) y saliva completa estimulada (SWS)⁹.

Los métodos introducidos en este manuscrito pueden identificar la infección oral por Candida a partir de los atributos morfológicos caracterizados (por ejemplo, las hifas y las células de levadura) en frotis directo o después del cultivo¹⁰. La identificación de la cepa de Candida utilizando un agar diagnóstico de Candida se basa en la formación de colonias de diferentes colores con morfología variada, que resultan de la escisión de sustratos cromogénicos por enzimas específicas de la especie¹¹. En este manuscrito, se introducen métodos sistemáticos para la detección de la infección oral por Candida , incluyendo el cultivo oral tradicional de Candida y el examen rápido mediante una prueba de frotis de hidróxido de potasio (KOH) y un ensayo de tinción con blanco de calcofluor (CFW)¹⁰. Además, se ha introducido la prueba de susceptibilidad a los antifúngicos, que puede guiar el tratamiento clínico de la infección oral por Candida . En situaciones reales, no es necesario realizar todos los métodos introducidos en este manuscrito; los métodos de detección oral de Candida se pueden seleccionar de acuerdo con el propósito. El examen de la infección oral por Candida y la determinación de cepas de Candida en pacientes con pSS no solo benefician el tratamiento de la enfermedad, sino que también ayudan a evaluar la caracterización de la candidiasis oral y los perfiles de especies.

Protocolo

Todos los procedimientos que se describen a continuación fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Tiantan de Pekín, Universidad Médica de la Capital (NO. KY2023-177-01), y todos los pacientes que participaron en este estudio dieron su consentimiento informado.

1. Criterios de inclusión y exclusión de pacientes

1. Criterios de inclusión: Clasificar a los pacientes como pacientes con SSp si cumplen con los criterios del Colegio Americano de Reumatología (ACR)/Liga Europea Contra el Reumatismo (EULAR) de 2016¹². En concreto, basar los criterios de clasificación final en la suma ponderada de cinco ítems: positividad de anticuerpos anti-SSA/Ro y sialadenitis linfocítica focal con una puntuación de foco de ≥ 1 focos/4^mm2, puntuando 3 cada uno; una puntuación de tinción ocular anormal de ≥ 5 (o una puntuación de van Bijsterveld de ≥ 4), un resultado de la prueba de Schirmer de ≤ 5 mm/5 min y una tasa de flujo salival no estimulado de ≤ 0,1 mL/min, cada una con una puntuación de 1. Las personas con signos y/o síntomas sugestivos de SS que tienen una puntuación total de ≥ 4 para los ítems anteriores cumplen con los criterios de pSS.
2. Criterios de exclusión: Excluir a los pacientes que no pueden cooperar con la recolección de muestras y a los pacientes que están recibiendo tratamiento para la infección oral por Candida .
   NOTA: Es esencial tener en cuenta que los métodos descritos a continuación también son adecuados para la caracterización integral de las infecciones orales por Candida en individuos con SS secundario.
3. Para prevenir posibles contaminaciones durante la recolección, el transporte y el cultivo de muestras de Candida , tome precauciones meticulosas. Esto incluye una preparación experimental meticulosa, el uso de materiales estériles y de un solo uso, el etiquetado adecuado, el sellado seguro de los tubos de muestreo y la realización de procedimientos experimentales en un gabinete de bioseguridad profesional.

2. Recogida de muestras

1. Recolección de saliva: Indique a los pacientes que sostengan el tubo con un embudo y dejen que la saliva fluya gradualmente hacia el tubo a lo largo del labio inferior. Al final de la recolección, pida al paciente que escupa toda la saliva restante en la boca en el tubo. Recoge la saliva durante 15 min.
2. Enjuague bucal y recolección de hisopos: Si el paciente no tiene flujo de saliva no estimulado o tiene un flujo de saliva no estimulado extremadamente bajo (menos de 0,03 mL/min), frote el área de la mucosa oral con sospecha de infección oral por Candida al menos 10 veces, luego pídale al paciente que use 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS; ver Tabla de materiales) para enjuagarse la boca durante 1 minuto. Guarde el enjuague bucal en un tubo estéril de 50 ml y coloque el hisopo en el tubo de enjuague bucal.
   NOTA: Para los pacientes con pSS con un flujo de saliva no estimulado de más de 0,03 mL/min, el paso 2.2 aún se puede utilizar para recolectar muestras para la detección de infecciones orales por Candida .

3. Procesamiento de muestras

1. Agregue 1 mL de PBS a la saliva recolectada. No agregue PBS en el enjuague bucal con PBS. Agite el tubo de enjuague bucal usando un vórtice durante 1 min.

4. Cultivo de cándida

1. Para hacer el medio de agar Sabourand (SDA), disuelva 70 g de SDA (ver Tabla de Materiales) en 1000 mL de agua bidestilada.
2. Estéril con un autoclave a 121 °C durante 15 min, placa 10 mL de este medio SDA en una placa de cultivo microbiológico de 10 cm (ver Tabla de Materiales) y enfriar.
3. Tome 200 μL de la muestra preparada en el paso 3 y escríbala en las placas de cultivo microbiológico de 10 cm preparadas con 10 mL de medio SDA en el paso 4.2.
4. Incubar durante 48 h a 37 °C, y la colonia de Candida madurará. Guarde temporalmente el plato SDA con colonias de Candida a 4 °C. Las colonias de Candida cultivadas en el plato SDA se pueden almacenar durante 2-4 semanas.

5. Identificación de la cepa de Candida

1. Para hacer el medio, saque 47,7 g de agar diagnóstico Candida (ver Tabla de materiales) en polvo, póngalo en 1000 mL de agua bidestilada y caliéntelo a 100 °C.
2. Cuando el medio esté ligeramente hirviendo, colocar 10 mL en una placa de cultivo microbiológico de 10 cm y dejar enfriar.
3. Disolver las colonias de Candida en 500 μL de medio SDA (paso 4), suspender y disociar mediante pipeteo.
4. Colocar 50 μL de la muestra con colonias de Candida (paso 5.3) en el medio preparado en el paso 5.2. Incubar durante 48 h a 37 °C hasta que las colonias de Candida estén maduras.
5. De acuerdo con el color y los patrones de las colonias de Candida , determine la(s) cepa(s) de la Candida adquirida de pacientes con pSS. Utilice los siguientes criterios de identificación de cepas de Candida : la colonia verde esmeralda es Candida albicans, la colonia gris azulada es Candida tropicalis, las colonias rosadas con bordes difusos y microvellosidades son Candida krusei, la pequeña colonia roja violácea es Candida glabrata, la colonia blanca lechosa contiene varias cepas, incluida Candida parapsilosis.

6. Ensayo de formación de biopelícula de Candida

1. Para hacer el medio de glucosa (G) a base de nitrógeno de levadura (YNB)-50, pese 1,34 g de YNB (ver Tabla de Materiales) y 1,98 g de D (+)-Glucosa (ver Tabla de Materiales). Disolverlos en 200 mL de agua bidestilada.
2. Para hacer el medio YNB-100G, saque 1,34 g de YNB y 3,96 g de D (+)-glucosa y disuélvalos en 200 mL de agua bidestilada.
3. Filtre las soluciones con un filtro de jeringa de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales). Los medios filtrados YNB-50G e YNB-100G se pueden almacenar a 4 °C durante 3 meses.
4. Elija las 3 (o más) colonias de la misma cepa en los platos en el paso 5 y transfiéralas a 200 μL de medio YNB-50G (pasos 6.1 y 6.3) en una placa de 96 pocillos (consulte la Tabla de materiales). Haga esto para las tensiones observadas en el plato. Cultivo durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm.
5. Aspirar la suspensión de Candida , añadir 1 mL de PBS, centrifugar las células de levadura a 1500 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Repite este paso 2 veces en el mismo tubo.
6. Resuspender las células en 1 mL de medio YNB-100G y preparar diferentes diluciones (1:10, 1:100 y 1:1000) de células. Tome 200 μL de suspensión de celda de gradiente y póngala en el medio SDA de 10 cm por el método de placa en espiral¹³. El recubrimiento se realiza utilizando una máquina que deposita un volumen conocido de muestra en una placa de agar giratoria en una cantidad cada vez menor en forma de espiral de Arquímedes. Cultivo durante 24-48 h a 37 °C.
7. Calcule la concentración de células en diferentes diluciones de acuerdo con el número de UFC en la placa SDA basado en un método estándar¹³. Cuente brevemente las colonias bien separadas en cada plato. Cuente las colonias en un octante desde el borde exterior hacia el centro hasta que se observen al menos 25 colonias. Además, cuente el resto de ese arco donde ocurrió el conteo número 25. Calcule la concentración de las células dividiendo el recuento de colonias por el volumen de líquido correspondiente al área sobre la que se obtuvo el recuento de colonias¹³. Ajuste la concentración de células a 1 x 10⁷ células/mL.
8. Coloque 100 μL de la suspensión celular en YNB-100G en una placa de 96 pocillos e incube a 37 °C durante 2 h mientras agita a 200 rpm.
9. Saque con cuidado el sobrenadante, lave 2 veces con PBS y retire las células de levadura flotantes. La biopelícula de Candida se forma en la parte inferior de la placa de 96 pocillos.

7. Ensayo de formación de hifas

NOTA: Solo la Candida que puede formar hifas (como la Candida albicans) puede ser inducida para la formación de hifas. Vaya al paso 8 para una mayor caracterización de Candida que no puede formar hifas (como Candida glabrata).

1. Vuelva a suspender la suspensión de células de levadura en el paso 6.6 y ajuste la concentración de células a 1 x 10⁶ células/mL con medio YNB-100G.
2. Para preparar el medio de crecimiento completo RPMI 1640, agregue 50 mL de suero fetal bovino (ver Tabla de Materiales) en 450 mL de medio RPMI 1640 (ver Tabla de Materiales) y almacene a 4 °C para realizar más experimentos.
3. Transfiera 2 μL de suspensión celular de Candida diluida en 200 μL de medio de crecimiento completo RPMI 1640 a una placa de 96 pocillos y cultive durante la noche a 37 °C para permitir que se formen las hifas y las células de levadura.

8. Prueba de frotis de KOH y ensayo de tinción de CFW

1. Extraiga 1 μL de muestras del paso 3 o del paso 6 o del paso 7 utilizando un bucle moldeado con precisión (consulte la tabla de materiales) y extienda un área de 1 cm x 1 cm en los portaobjetos de vidrio. Espera a que se seque a temperatura ambiente.
2. Para hacer una solución de KOH al 10%, pese 10 g de polvo de KOH (consulte la Tabla de materiales) y disuélvalo en 100 ml de agua bidestilada.
3. Caliente ligeramente el portaobjetos con una lámpara de alcohol hasta que la muestra se disuelva. Teñir los portaobjetos preparados en el paso 8.1 con un 10% de KOH (paso 8.2) y cubrir con un cubreobjetos. Presione ligeramente el cubreobjetos para que la muestra quede transparente.
4. Visualiza las hifas y las células de levadura bajo el microscopio.
5. Manche los portaobjetos preparados en el paso 8.1 con una gota de CFW (consulte la Tabla de materiales), cubra con un cubreobjetos y espere 1 min.
6. Visualice las hifas utilizando un microscopio de fluorescencia con aumentos de 100x y 200x. CFW se excita a 355 nm y se detecta a 300-440 nm. Fotografía las imágenes bajo el tiempo de exposición. Repita 3 veces para evitar resultados falsos positivos.

9. Prueba de susceptibilidad a los antifúngicos

NOTA: Esta prueba se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit de susceptibilidad a hongos similares a levaduras (microdilución; consulte la tabla de materiales).

1. Prepare colonias de Candida (paso 4) de menos de 4 días de edad con la ampolla de NaCl al 0,85% (ver Tabla de Materiales) y adquiera la suspensión que tenga una turbidez equivalente a 2 McFarland. Determine la turbidez de acuerdo con el kit de estándares de McFarland (consulte la tabla de materiales). Utilice la suspensión de Candida preparada al instante.
2. Pipetee 135 μL de medio ATB F2 en el kit que contiene 3 x 10⁴ células de levadura/ml en cada cúpula de la tira reactiva y coloque la tapa. Coloque la tira reactiva en un recipiente sellado. Cultivo durante 24 h a 35 °C.
3. Observe el crecimiento de la cándida con interpretación visual (consulte el manual del usuario). Para conocer el valor de referencia (rango de referencia), consulte el manual del usuario. Compruebe si el orificio de control está creciendo adecuadamente. Si el crecimiento del hoyo de control es insuficiente o no crece, entonces los resultados no se pueden leer y necesitan otras 24 h de cultivo.

Resultados

En este estudio, se seleccionaron 12 pacientes con pSS como pacientes representativos y se les realizó un cribado de detección de infección oral por Candida (Tabla 1). Entre estos pacientes, algunos pacientes presentaban lesiones orales típicas de la infección por Candida , incluyendo queilitis angular (caracterizada por grietas en las comisuras de la boca, descamación e hiperemia, Figura 1A), edema rojo brillante en la mucosa gingival, pseudomembrana...

Discusión

En el presente manuscrito, proporcionamos una serie de métodos sistemáticos, simples y factibles para detectar infecciones orales por Candida , identificar cepas de Candida y probar la susceptibilidad antifúngica de los medicamentos de uso común en pacientes con pSS.

En la práctica, no todos los métodos introducidos en este manuscrito son necesarios. Los métodos de detección oral de Candida se pueden elegir en función del propósito específico. Las pruebas...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filter	MERCK	SLGV004SL
1.5 mL Centrifuge Tube	axygen	MCT-150-C-S
10 cm Microbiological Culture Dishes	Jet Bio-Filtration Co. Ltd	TCD000100
15 mL Centrifuge Tube	Jet Bio-Filtration Co., Ltd	CFT011150
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430290
96-well Microplates	Corning	3599
API 0.85% NaCl ampule	BIOMERIEUX	20070
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
CHROMagar Candida	CHROMagar	P002860	Candida diagnostic agar
D(+)-Glucose Monohydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010518
Fetal Bovine Serum	Gibco	26170035
McFarland Standards Kit	BIOMERIEUX	70900
Nunc precision molded loops	ThermoFisher Scientific	254399
Phosphate Buffered Saline	Gibco	C10010500BT
Potassium Hydroxide	Aladdin	P112284-500g
PowerSoil DNA Isolation Kit	MO BIO	12888-50
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875119
Sabourand's Agar Medium	Solarbio	S9710
Yeast Nitrogen Base Without Amino acids	Solarbio	Y8040
Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution)	BIOMERIEUX	14204