Exame de Infecção Oral por Candida em Pacientes com Síndrome de Sjögren Primária

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para o exame da infecção oral por Candida em pacientes com síndrome de Sjögren primária, que pode ser usado para tratamento oportuno e, posteriormente, evitando complicações relacionadas.

Resumo

A síndrome de Sjögren primária (SSp) é uma doença autoimune caracterizada por sintomas como boca seca, olhos secos e outros sintomas sistemáticos. Devido à hipossalivação experimentada por pacientes com SSP, freqüentemente ocorre disbacteriose oral. Uma complicação comum da SSp é a infecção oral por Candida . Neste artigo, os autores descrevem métodos sistemáticos que podem diagnosticar efetivamente a infecção oral por Candida e identificar as cepas de Candida usando saliva, esfregaços de mucosa oral ou enxaguatório bucal de pacientes com SSP. O ágar dextrose de Sabouraud (SDA), o ensaio de formação de hifas, o teste de esfregaço de hidróxido de potássio (KOH) e o ensaio de coloração branca de calcofluor (CFW) são usados para o diagnóstico de infecção oral por Candida . Um ágar diagnóstico de Candida é usado para a identificação de cepas de Candida . Finalmente, o teste de suscetibilidade antifúngica é usado para determinar o tratamento adequado com medicamentos antifúngicos. Este método padronizado pode melhorar o diagnóstico, o tratamento e a pesquisa futura de infecções orais por Candida relacionadas à SSp. O diagnóstico precoce, usando este método, também pode prevenir quaisquer complicações decorrentes do atraso no tratamento adequado.

Introdução

A candidíase é causada por Candida spp., que são patógenos oportunistas. As cepas comuns incluem Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis e Candida dubliniensis¹. As infecções oportunistas causadas por Candida spp. incluem infecções superficiais por Candida e candidíase invasiva. A candidíase invasiva ocorre principalmente em indivíduos imunocomprometidos; por exemplo, em pacientes com síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), a candidíase invasiva pode ameaçar significativamente a qualidade de vida ou mesmo a expectativa de vida². A infecção superficial por Candida , como a candidíase mucocutânea, é mais comum em pacientes³.

A candidíase oral, uma infecção superficial por Candida , é a infecção fúngica humana mais comum. Candida albicans é um comensal normal da boca; a taxa de transporte de Candida spp. foi relatado como variando de 20% a 75% na população em geral sem nenhum sintoma⁴. O crescimento excessivo de Candida pode levar a desconforto local nos pacientes, como paladar alterado da sensação, sensação de queimação na boca, disfagia devido à má nutrição, recuperação retardada e internação prolongada. A candidíase oral a longo prazo pode levar à candidíase invasiva grave, resultando em morbidade e mortalidade significativas⁵. A candidíase oral também pode aumentar o risco de câncer bucal⁵. A função das glândulas salivares prejudicada está entre os fatores de risco para candidíase oral⁶. O início da infecção é a adesão de Candida às paredes celulares epiteliais. Isso é seguido pela proliferação e filamentação de Candida e pela formação e maturação do biofilme⁷. Os biofilmes são extremamente difíceis de erradicar e são resistentes ao tratamento antifúngico convencional, tornando o tratamento clínico um desafio para a infecção oral por Candida associada ao biofilme⁷.

A síndrome de Sjögren primária (SSp) é uma doença autoimune caracterizada por boca seca, olhos secos e outros sintomas sistemáticos⁸. A boca seca é o sintoma mais frequente da SSP. A saliva tem importantes funções antifúngicas fisiológicas. Por um lado, pode diluir e vasculhar a boca e, posteriormente, remover organismos da mucosa. Por outro lado, a saliva contém proteínas antimicrobianas, como lactoferrina, sialoperoxidase, lisozima, polipeptídeos ricos em histidina e anticorpos anti-candida específicos, que podem interagir com a mucosa oral e prevenir o crescimento excessivo de Candida⁶. O fluxo salivar reduzido pode predispor os pacientes com SSp à candidíase oral. Um estudo observacional transversal realizado em 61 pacientes com SSp constatou que 13,1% dos pacientes com SSp apresentavam sinais orais de candidíase e a unidade formadora de colônias (UFC)/mL de Candida albicans foi encontrada significativa e negativamente correlacionada com os níveis de saliva total não estimulada (UWS) e saliva total estimulada (SWS)⁹.

Os métodos introduzidos neste manuscrito podem identificar a infecção oral por Candida com base em atributos morfológicos caracterizados (por exemplo, hifas e células de levedura) em esfregaço direto ou após cultura¹⁰. A identificação da cepa de Candida usando um ágar diagnóstico de Candida é baseada na formação de colônias de diferentes cores com morfologia variada, que resultam da clivagem de substratos cromogênicos por enzimas espécie-específicas¹¹. Neste manuscrito, são introduzidos métodos sistemáticos para detectar a infecção oral por Candida , incluindo a cultura oral tradicional de Candida e o exame rápido por teste de esfregaço de hidróxido de potássio (KOH) e ensaio de coloração branca de calcofluor (CFW)¹⁰. Além disso, foi introduzido o teste de suscetibilidade antifúngica, que pode orientar o tratamento clínico oral da infecção por Candida . Em situações reais, não é necessário executar todos os métodos introduzidos neste manuscrito; o(s) método(s) de detecção oral de Candida pode(m) ser selecionado(s) de acordo com a finalidade. O exame da infecção oral por Candida e a determinação de cepas de Candida em pacientes com SSp não apenas beneficiam o tratamento da doença, mas também ajudam a avaliar a caracterização da candidíase oral e os perfis das espécies.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Ética do Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University (NO. KY2023-177-01), e todos os pacientes envolvidos neste estudo forneceram consentimento informado.

1. Critérios de inclusão e exclusão de pacientes

1. Critérios de inclusão: Classificar os pacientes como pacientes com SSp se eles preencherem os critérios de 2016 do American College of Rheumatology (ACR)/European League Against Rheumatism (EULAR)¹². Especificamente, basear os critérios de classificação final na soma ponderada de cinco itens: positividade de anticorpos anti-SSA/Ro e sialadenite linfocítica focal com escore focal de ≥ 1 foco/4^mm2, cada um com escore 3; um escore de coloração ocular anormal de ≥ 5 (ou escore de van Bijsterveld de ≥ 4), um resultado do teste de Schirmer de ≤ 5 mm/5 min e uma taxa de fluxo salivar não estimulado de ≤ 0,1 mL/min, cada um pontuando 1. Indivíduos com sinais e/ou sintomas sugestivos de SS que têm uma pontuação total de ≥ 4 para os itens acima atendem aos critérios para SSp.
2. Critério de exclusão: Excluir pacientes que não podem cooperar com a coleta de amostras e pacientes que estão recebendo tratamento para infecção oral por Candida .
   NOTA: É essencial observar que os métodos descritos abaixo também são adequados para a caracterização abrangente de infecções orais por Candida em indivíduos com SS secundária.
3. Para evitar possíveis contaminações durante a coleta, transporte e cultura de amostras de Candida , tome precauções meticulosas. Isso inclui preparação experimental meticulosa, uso de materiais descartáveis e estéreis, rotulagem adequada, vedação segura de tubos de amostragem e realização de procedimentos experimentais em um gabinete de biossegurança profissional.

2. Coleta de amostras

1. Coleta de saliva: Instrua os pacientes a segurar o tubo com um funil e deixar a saliva fluir gradualmente para dentro do tubo ao longo do lábio inferior. No final da coleta, peça ao paciente para cuspir toda a saliva restante na boca no tubo. Colete a saliva por 15 min.
2. Enxaguatório bucal e coleta de swab: Se o paciente não tiver fluxo de saliva não estimulado ou tiver fluxo de saliva não estimulado extremamente baixo (menos de 0,03 mL / min), esfregue a área da mucosa oral com suspeita de infecção oral por Candida pelo menos 10 vezes e, em seguida, peça ao paciente para usar 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS; ver Tabela de Materiais) para enxaguar a boca por 1 min. Guarde o enxaguatório bucal em um tubo estéril de 50 mL e coloque o cotonete no tubo de enxaguatório bucal.
   NOTA: Para pacientes com SSp com fluxo de saliva não estimulado superior a 0,03 mL / min, a etapa 2.2 ainda pode ser usada para coletar amostras para detecção de infecção oral por Candida .

3. Processamento de amostras

1. Adicione 1 mL de PBS à saliva coletada. Não adicione PBS no enxaguatório bucal com PBS. Vibre o tubo de enxaguatório bucal usando um vórtice por 1 min.

4. Cultura de Candida

1. Para fazer o meio de ágar Sabourand (SDA), dissolva 70 g de SDA (ver Tabela de Materiais) em 1000 mL de água bidestilada
2. Estéril com autoclave a 121 °C por 15 min, coloque 10 mL deste meio SDA em uma placa de cultura microbiológica de 10 cm (consulte a Tabela de Materiais) e resfrie.
3. Pegue 200 μL de amostra preparada na etapa 3 e coloque-a nas placas de cultura microbiológica de 10 cm preparadas com 10 mL de meio SDA na etapa 4.2.
4. Incube por 48 h a 37 ° C e a colônia de Candida amadurecerá. Conservar temporariamente a placa SDA com colónias de Candida a 4 °C. As colônias de Candida cultivadas na placa SDA podem ser armazenadas por 2-4 semanas.

5. Identificação da cepa de Candida

1. Para fazer o meio, retire 47,7 g de pó de ágar diagnóstico de Candida (ver Tabela de Materiais), coloque-o em 1000 mL de água bidestilada e aqueça-o a 100 ° C.
2. Quando o meio estiver ligeiramente em ebulição, colocar 10 ml numa placa de cultura microbiológica de 10 cm e deixar arrefecer.
3. Dissolva as colônias de Candida em 500 μL de meio SDA (etapa 4), suspenda e dissocie por pipetagem.
4. Colocar 50 μL da amostra com colônias de Candida (etapa 5.3) no meio preparado na etapa 5.2. Incubar durante 48 h a 37 °C até que as colónias de Candida estejam maduras.
5. De acordo com a cor e os padrões das colônias de Candida , determine a(s) cepa(s) da Candida adquirida de pacientes com SSP. Use os seguintes critérios de identificação da cepa de Candida : a colônia verde-esmeralda é Candida albicans, a colônia cinza-azulada é Candida tropicalis, as colônias rosa com bordas difusas e as microvilosidades são Candida krusei, a pequena colônia vermelha arroxeada é Candida glabrata, a colônia branca leitosa contém várias cepas, incluindo Candida parapsilosis.

6. Ensaio de formação de biofilme de Candida

1. Para fazer o meio de glicose (G) à Base de Nitrogênio de Levedura (YNB)-50, pese 1,34 g YNB (ver Tabela de Materiais) e 1,98 g D (+)-Glicose (ver Tabela de Materiais). Dissolva-os em 200 mL de água bidestilada
2. Para fazer o meio YNB-100G, retire 1,34 g de YNB e 3,96 g de D (+) -Glicose e dissolva-os em 200 mL de água bidestilada
3. Filtre as soluções com um filtro de seringa de 0,22 μm (consulte a Tabela de Materiais). Os meios filtrados YNB-50G e YNB-100G podem ser armazenados a 4 °C por 3 meses.
4. Escolha as 3 (ou mais) colônias da mesma cepa nas placas na etapa 5 e transfira-as para 200 μL de meio YNB-50G (etapas 6.1 e 6.3) em uma placa de 96 poços (consulte a Tabela de Materiais). Faça isso para as cepas observadas no prato. Cultura durante a noite a 37 °C com agitação a 200 rpm.
5. Aspire a suspensão de Candida , adicione 1 mL de PBS, centrifugue as células de levedura a 1500 x g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa 2x no mesmo tubo.
6. Ressuspenda as células em 1 mL de meio YNB-100G e prepare diferentes diluições (1:10, 1:100 e 1:1000) das células. Pegue 200 μL de suspensão de célula gradiente e coloque-a no meio SDA de 10 cm pelo método da placa espiral¹³. O revestimento é feito usando uma máquina que deposita um volume conhecido de amostra em uma placa de ágar rotativa em uma quantidade cada vez menor na forma de uma espiral de Arquimedes. Cultura durante 24-48 h a 37 °C.
7. Calcular a concentração de células em diferentes diluições de acordo com o número de UFC na placa SDA com base num método normalizado¹³. Conte brevemente as colônias bem separadas em cada placa. Conte as colônias em um octante da borda externa em direção ao centro até que pelo menos 25 colônias sejam observadas. Além disso, conte o restante do arco onde ocorreu a^25ª contagem. Calcule a concentração das células dividindo a contagem de colônias pelo volume líquido correspondente à área sobre a qual a contagem de colônias foi obtida¹³. Ajuste a concentração de células para 1 x 10⁷ células / mL.
8. Coloque 100 μL da suspensão celular em YNB-100G em uma placa de 96 poços e incube a 37 ° C por 2 h agitando a 200 rpm.
9. Retire cuidadosamente o sobrenadante, lave 2x com PBS e retire as células de levedura flutuantes. O biofilme de Candida se forma na parte inferior da placa de 96 poços.

7. Ensaio de formação de hifas

NOTA: Apenas Candida que pode formar hifas (como Candida albicans) pode ser induzida para a formação de hifas. Vá para a etapa 8 para uma caracterização mais aprofundada de Candida que não pode formar hifas (como Candida glabrata).

1. Ressuspenda a suspensão de células de levedura na etapa 6.6 e ajuste a concentração celular para 1 x 10⁶ células/mL com meio YNB-100G.
2. Para preparar o meio de crescimento completo RPMI 1640, adicione 50 mL de soro fetal bovino (ver Tabela de Materiais) em 450 mL de meio RPMI 1640 (ver Tabela de Materiais) e armazene a 4 ° C para experimentos adicionais.
3. Transfira 2 μL de suspensão de células de Candida diluída em 200 μL de meio de crescimento completo RPMI 1640 para uma placa de 96 poços e cultive durante a noite a 37 ° C para permitir a formação de hifas e células de levedura.

8. Teste de esfregaço KOH e ensaio de coloração CFW

1. Retire 1 μL de amostras da etapa 3 ou etapa 6 ou etapa 7 usando um laço moldado com precisão (consulte a Tabela de Materiais) e espalhe uma área de 1 cm x 1 cm nas lâminas de vidro. Espere secar em temperatura ambiente.
2. Para fazer uma solução de KOH a 10%, pesar 10 g de pó de KOH (ver Tabela de Materiais) e dissolva-o em 100 mL de água bidestilada
3. Aqueça levemente a lâmina com uma lâmpada de álcool até que a amostra se dissolva. Pintar as lâminas preparadas na etapa 8.1 com 10% de KOH (etapa 8.2) e cobrir com uma lamínula. Pressione levemente a lamínula para tornar a amostra transparente.
4. Visualize as hifas e as células de levedura ao microscópio.
5. Manchar as lâminas preparadas na etapa 8.1 com uma gota de CFW (ver Tabela de Materiais), cobrir com uma lamínula e aguardar 1 min.
6. Visualize as hifas usando um microscópio de fluorescência nas ampliações de 100x e 200x. CFW é excitado em 355 nm e detectado em 300-440 nm. Fotografe as imagens sob o tempo de exposição. Repita 3x para evitar resultados falsos positivos.

9. Teste de suscetibilidade antifúngica

NOTA: Este teste é realizado de acordo com as instruções do fabricante para o Kit de Suscetibilidade a Fungos Semelhantes a Leveduras (Microdiluição; consulte a Tabela de Materiais).

1. Prepare colônias de Candida (etapa 4) com menos de 4 dias de idade com a ampola de NaCl a 0,85% (consulte a Tabela de Materiais) e adquira a suspensão com turbidez equivalente a 2 McFarland. Determine a turbidez de acordo com o Kit de Padrões McFarland (consulte a Tabela de Materiais). Use a suspensão de Candida preparada instantaneamente.
2. Pipetar 135 μL de meio ATB F2 no kit contendo 3 x 10⁴ células de levedura/ml em cada cúpula da tira de ensaio e colocar a tampa. Coloque a tira de teste em um recipiente lacrado. Cultura durante 24 h a 35 °C.
3. Observe o crescimento da Candida com interpretação visual (consulte o manual do usuário). Para o valor de referência (intervalo de referência), consulte o manual do usuário. Verifique se o orifício de controle está crescendo adequadamente. Se o crescimento do orifício de controle for insuficiente ou não crescer, os resultados não podem ser lidos e precisam de mais 24 horas de cultivo.

Resultados

Neste estudo, 12 pacientes com SSp foram selecionados como pacientes representativos e triados para infecção oral por Candida (Tabela 1). Entre esses pacientes, alguns pacientes exibiram lesões orais típicas de infecção por Candida , incluindo queilite angular (caracterizada por rachaduras nos cantos da boca, descamação e hiperemia, Figura 1A), edema vermelho vivo na mucosa gengival, pseudomembrana fibrosa branco-amarelada (Figu...

Discussão

No presente manuscrito, fornecemos uma série de métodos sistemáticos, simples e viáveis para detectar infecções orais por Candida , identificar cepas de Candida e testar a suscetibilidade antifúngica de medicamentos comumente usados em pacientes com SSP.

Em ambientes práticos, nem todos os métodos apresentados neste manuscrito são necessários. O(s) método(s) de detecção oral de Candida pode(m) ser escolhido(s) com base na finalidade específica. Os tes...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filter	MERCK	SLGV004SL
1.5 mL Centrifuge Tube	axygen	MCT-150-C-S
10 cm Microbiological Culture Dishes	Jet Bio-Filtration Co. Ltd	TCD000100
15 mL Centrifuge Tube	Jet Bio-Filtration Co., Ltd	CFT011150
50 mL Centrifuge Tube	Corning	430290
96-well Microplates	Corning	3599
API 0.85% NaCl ampule	BIOMERIEUX	20070
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
CHROMagar Candida	CHROMagar	P002860	Candida diagnostic agar
D(+)-Glucose Monohydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010518
Fetal Bovine Serum	Gibco	26170035
McFarland Standards Kit	BIOMERIEUX	70900
Nunc precision molded loops	ThermoFisher Scientific	254399
Phosphate Buffered Saline	Gibco	C10010500BT
Potassium Hydroxide	Aladdin	P112284-500g
PowerSoil DNA Isolation Kit	MO BIO	12888-50
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875119
Sabourand's Agar Medium	Solarbio	S9710
Yeast Nitrogen Base Without Amino acids	Solarbio	Y8040
Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution)	BIOMERIEUX	14204