神経突起伸長測定のための新しい半自動ソフトウェアの標準化

要約

神経突起伸長アッセイは、再生ニューロンプロセスに関する定量的な値を提供します。この半自動ソフトウェアの利点は、マスクを作成することで細胞体と神経突起を別々にセグメント化し、神経突起の長さ、分岐点の数、細胞体クラスター面積、細胞クラスター数などのさまざまなパラメータを測定できることです。

要約

神経突起の伸長をリアルタイムで測定するためには、神経細胞の形態を評価するために、効果的なライブイメージング技術が不可欠です。神経突起伸長の適切な測定は、神経科学研究分野で長年にわたる課題でした。このパラメータは、解離培養や器官型培養から細胞株に至るまで、数多くの in vitro 実験セットアップの基礎として機能します。神経突起の長さを定量化することにより、特定の治療が機能したかどうか、または軸索再生がさまざまな実験グループで促進されたかどうかを判断することができます。この研究では、Incucyte Neurotrack 神経突起伸長解析ソフトウェアの堅牢性と精度を実証することを目的としています。この半自動ソフトウェアは、位相差画像の神経突起長の定量化において一般的に使用される方法論に比べていくつかの利点を提供するタイムラプス顕微鏡システムで利用できます。このアルゴリズムは、各画像内のいくつかのパラメーターをマスクして定量化し、神経突起の長さ、分岐点、細胞体クラスター、細胞体クラスター領域などのニューロン細胞メトリクスを返します。まず、ソフトウェアの堅牢性と精度を、フィジーのプラグインである手動のNeuronJの値と相関させることで検証しました。次に、位相差画像と免疫細胞化学画像の両方で機能できるアルゴリズムを使用しました。特異的なニューロンマーカーを用いて、感覚ニューロンの in vitro 培養における蛍光ベースの神経突起伸長解析の実現可能性を検証しました。さらに、このソフトウェアは、個々の細胞から複雑なニューロンネットまで、さまざまな播種条件で神経突起の長さを測定できます。結論として、このソフトウェアは、神経突起伸長アッセイのための革新的で時間効率の良いプラットフォームを提供し、より迅速で信頼性の高い定量への道を開きます。

概要

坐骨神経では、軸索再生¹を測定することが可能です。さらに、in vitro研究は、健康なニューロンと損傷したニューロンの両方において、軸索発芽から軸索変性までのさまざまな段階を理解するために、軸索伸長^2,3を監視することの実現可能性を示しています。これらのプロセスを追跡することにより、軸索の極性、開始、安定性、分岐などのパラメータを測定することができます。最後のパラメータは、神経障害性疼痛の知覚を理解するために重要です^4,5,6。同様に、軸索変性はin vivo⁷ またはin vitro ^8,9で監視できます。神経突起伸長中、アクチンおよび微小管の細胞骨格ネットワークは、細胞¹⁰の必要性に応じて安定化または変化する。アクチン細胞骨格は、....

プロトコル

1.機械で容器をスキャンする

注:検出は、内蔵のBasler Ace 1920-155 μmカメラによって行われます。

1. 「 Connect to Device 」をクリックし、「 Schedule - To Acquire」を選択して、プログラムを開きます。次に、 + 記号をクリックします。
2. 船舶を繰り返しスキャンするか、1回のみスキャンするかを指定するには、それぞれ「 スケジュールに従ってスキャン 」または「 今すぐ1回スキャン」オプションを選択します。
3. 新規 を選択して、スキャンする新しい船舶を作成します。新しい船舶が追加されていない場合は、以下で説明するオプションのいずれかを使用して新しいスキャンを作成します。
   1. [ 現在の コピー]を選択し、現在のスケジュールから船舶をコピーして新しい船舶を作成します。「 Copy Previous 」を選択して、以前にスキャンした船舶をコピーして新しい船舶を作成します。
   2. <....

ディスカッション

健康な状態、負傷した状態、および病気の状態でニューロンがどのように成長するかを正確に測定することは、神経科学分野の多くの実験設定において重要なパラメーターです。DRG外植片全体の器官型培養物を扱う場合でも、解離した培養物を扱う場合でも、軸索伸長を適切に測定することは、過去20年間にわたる大きな課題でした。神経突起伸長の信頼性と精度の?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase A	Merck / Roche	10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II)	Merck / Roche	4942078001
Dulbecco's modified eagle's medium	Merck / Sigma	D5796
Fetal bovin serum	Merck / Sigma	F7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)	ThermoFisher Scientific	21765029
Ham's F12 w/ L-Glutamine	Euroclone	ECM0135L
Hanks' Balanced Salt Solution	Euroclone	ECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.)	Cytiva	SH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software	Sartorius	9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)	Millipore/Sigma	L5520
Laminin Mouse Protein, Natural	ThermoFisher Scientific	23017015
L-Cysteine	Merck / Sigma	C7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine	Euroclone	ECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)	Alomone Labs	N-100
Neurobasal Medium [-] Glutamine	ThermoFisher Scientific	21103049
NSC-34	CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)	CLU140
Papain from papaya latex	Sigma	P4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL)	Cytiva	17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)	EMD Millipore/Merck	A-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)	Sigma	P4832
Recombinant Human NT-3	PeproTech	450-03
Retinoic Acid	Merck / Sigma	R2625
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibody	Merck / Sigma	T8660