Padronização de um novo software semiautomático para medição de crescimento de neuritos

Resumo

Os ensaios de crescimento de neuritos fornecem um valor quantitativo sobre os processos neuronais regenerativos. A vantagem deste software semiautomático é que ele segmenta corpos celulares e neurites separadamente, criando uma máscara e mede vários parâmetros, como comprimento de neurites, número de pontos de ramificação, área de aglomerado de células-corpo e número de aglomerados de células.

Resumo

Técnicas eficazes de imagem ao vivo são cruciais para avaliar a morfologia neuronal, a fim de medir o crescimento de neuritos em tempo real. A medição adequada do crescimento de neuritos tem sido um desafio de longa data ao longo dos anos no campo de pesquisa em neurociência. Este parâmetro serve como uma pedra angular em várias configurações experimentais in vitro , variando de culturas dissociadas e culturas organotípicas a linhagens celulares. Ao quantificar o comprimento dos neuritos, é possível determinar se um tratamento específico funcionou ou se a regeneração axonal é aumentada em diferentes grupos experimentais. Neste estudo, o objetivo é demonstrar a robustez e precisão do software de análise de crescimento de neuritos Incucyte Neurotrack. Este software semi-automático está disponível em um sistema de microscopia de lapso de tempo que oferece várias vantagens sobre as metodologias comumente usadas na quantificação do comprimento do neurite em imagens de contraste de fase. O algoritmo mascara e quantifica vários parâmetros em cada imagem e retorna métricas de células neuronais, incluindo comprimento de neuritos, pontos de ramificação, aglomerados de corpos celulares e áreas de aglomerados de corpos celulares. Em primeiro lugar, validamos a robustez e precisão do software correlacionando seus valores com os do NeuronJ manual, um plug-in de Fiji. Em segundo lugar, usamos o algoritmo que é capaz de trabalhar tanto em imagens de contraste de fase quanto em imagens imunocitoquímicas. Usando marcadores neuronais específicos, validamos a viabilidade da análise de crescimento de neuritos baseada em fluorescência em neurônios sensoriais em culturas in vitro . Além disso, este software pode medir o comprimento dos neuritos em várias condições de semeadura, desde células individuais até redes neuronais complexas. Em conclusão, o software fornece uma plataforma inovadora e eficaz em termos de tempo para ensaios de crescimento de neuritos, abrindo caminho para quantificações mais rápidas e confiáveis.

Introdução

Nos nervos ciáticos, é possível medir a regeneração axonal¹. Além disso, estudos in vitro mostraram a viabilidade de monitorar o crescimento axonal ^2,3 para compreender suas várias fases, desde o brotamento axonal até a degeneração axonal, em neurônios saudáveis e lesionados. Ao rastrear esses processos, é possível medir parâmetros como polaridade axonal, iniciação, estabilidade e ramificação. Este último parâmetro é crucial para entender a percepção da dor neuropática ^4,5,6<....

Protocolo

1. Escaneando o recipiente na máquina

NOTA: A detecção é realizada pela câmera Basler Ace 1920-155 μm integrada.

1. Abra o programa clicando em Conectar ao dispositivo e selecionando Agendar - Adquirir. Em seguida, clique no sinal + .
2. Especifique se a embarcação será escaneada repetidamente ou apenas 1x escolhendo a opção Scan on Schedule ou Scan Once Now, respectivamente.
3. Selecione Novo para criar um novo recipiente para escanear. Se um novo recipiente não for ad....

Discussão

Medir com precisão como os neurônios crescem em condições saudáveis, feridas e doentes é um parâmetro crítico em muitas configurações experimentais no campo da neurociência. Seja trabalhando com culturas organotípicas de explantes DRG inteiros ou culturas dissociadas, medir adequadamente o crescimento axonal tem sido um desafio significativo nos últimos 20 anos. Sem uma quantificação confiável e precisa do crescimento de neuritos, é impossível avaliar se um tratamento e.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase A	Merck / Roche	10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II)	Merck / Roche	4942078001
Dulbecco's modified eagle's medium	Merck / Sigma	D5796
Fetal bovin serum	Merck / Sigma	F7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)	ThermoFisher Scientific	21765029
Ham's F12 w/ L-Glutamine	Euroclone	ECM0135L
Hanks' Balanced Salt Solution	Euroclone	ECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.)	Cytiva	SH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software	Sartorius	9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)	Millipore/Sigma	L5520
Laminin Mouse Protein, Natural	ThermoFisher Scientific	23017015
L-Cysteine	Merck / Sigma	C7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine	Euroclone	ECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)	Alomone Labs	N-100
Neurobasal Medium [-] Glutamine	ThermoFisher Scientific	21103049
NSC-34	CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)	CLU140
Papain from papaya latex	Sigma	P4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL)	Cytiva	17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)	EMD Millipore/Merck	A-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)	Sigma	P4832
Recombinant Human NT-3	PeproTech	450-03
Retinoic Acid	Merck / Sigma	R2625
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibody	Merck / Sigma	T8660