Los autores desean agradecer el apoyo y asesoramiento técnico de Ren Sol (Universidad de California, Los Angeles) y Seungmin Hwang (Universidad de Washington). Este trabajo fue financiado por la Fundación Baxter, los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (R01 y R21 CA140964 AI083841 a C. Liang).

El siguiente protocolo se describe el estudio de los títulos de virus y la carga viral del genoma en el ciclo de infección lítica y latente de γHV68 en ratones, lo que teóricamente se puede utilizar para evaluar la infección por virus que comparten el estilo de vida similar a la de γHV68. 1. La amplificación de γHV68 <ol><li> Descongelar un vial congelado de γHV68 de 37 ° C baño de agua. </li><li> Añadir inóculo viral NIH3T12 o cultivo de células 3T3 (~ 50% de confluencia) en platos de 10 cm y la cultura de las células infectadas a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Examinar la cultura mediante microscopía de efecto citopático (ECP) y recoger los medios de comunicación en un momento en que más del 80% de las células muestran CPE 4 ~ 5 días después de la infección. Para maximizar el rendimiento de los virus, el cultivo de células infectadas pueden ser congelados y descongelados dos veces para liberar a todos los asociados a células γHV68. </li><li> Centrifugar los medios de comunicación recogieron a 1000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente (TA) para eliminar los restos celulares. </li><li> Transfiera cuidadosamente los sobrenadantes a nuevos tubos (tubo de alta velocidad de centrifugado) sin tocar los restos celulares en la parte inferior. </li><li> De alta velocidad se centrifuga a 12.000 rpm (para Sorvall SA-600) a 4 ° C durante por lo menos 1,5 horas de concentración de partículas virales. </li><li> Descartar el sobrenadante en una solución de lejía 10γ y cuidadosamente vuelva a suspender el pellet (virus y restos celulares residual) con 1 ml de suero libre de DMEM. Transferencia de la re-suspensión de pellets en un 1,5 ml micro-tubo de centrifugadora y mezclar adecuadamente por agitación. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a velocidad máxima para eliminar los restos celulares residual y la transferencia del sobrenadante (stock de virus) a un nuevo tubo. Este es el balance definitivo de la infección viral. El título de la acción del virus se determina mediante el ensayo de la placa (ver más abajo). </li></ol> 2. La infección intranasal de ratones con γHV68 <ol><li> Infectar a los ratones en unas 6 semanas de edad con 1.000 ~ 5.000 unidades formadoras de placas (UFP) de ratones por γHV68. </li><li> Anestesiarratones mediante la inyección de ketamina / xilazina (60 l / ratón de una mezcla de 80 mg / ml de ketamina y xilacina 12 mg / ml) en la cavidad peritoneal. Monitor de anestesia pellizcando la punta ratones. Por lo general toma min ~ 10.5. Si los ratones no son totalmente anestesiado, se estornudar el virus. </li><li> Cuando el ratón está totalmente anestesiado, el uso de una pipeta para inocular ~ 30 l de PBS que contenía γHV68 (15 l en cada fosa nasal) a ratones gota a gota, lentamente pero sin pausa. Asegúrese de que el ratón es de hecho la inhalación de las gotas, sin tratar de formar burbujas. </li><li> Permitir el ratón para recuperar durante 10-15 minutos y vigilar el bienestar de los ratones (por ejemplo, la conciencia, la respiración, etc) antes de regresar a la jaula. Los animales se comprueban todos los días por enfermedad y la adecuación de los alimentos, el agua y las condiciones de camas. Si los signos clínicos de la enfermedad, el dolor o la angustia desarrollo, el diagnóstico de rutina para determinar la etiología se llevará a cabo. Los animales que pierden más del 20% de su peso corporal se registró la pérdida de peso máximoy la eutanasia. La decisión final para llevar a cabo la eutanasia está en la discreción del veterinario clínico y tras consultar con el investigador principal. </li></ol> 3. Placa de ensayo para determinar el título del virus en los pulmones con infección aguda <ol><li> Los títulos de infectividad del virus se determina por la formación de placas en monocapas de células Vero. </li><li> Células Vero se siembran en 2.5x10 4 células / pocillo en placas de 12 pocillos, el día antes de la placa de ensayo. Las células deben estar uniformemente distribuida y la densidad celular debe llegar a 30 - 40% en el día de la placa de ensayo. </li><li> Prepare un 0,5% (w / v) de metilcelulosa (MC) medio de recubrimiento (Tabla 1). </li><li> Sacrificio γHV68 ratones infectados 5-7 días después de la infección intranasal para determinar la fase aguda de los títulos de virus en los pulmones. Para la eutanasia Ketamina HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) será administrado IM seguido por sobredosis intravenosa de pentobarbital Na (30-50 mg / kg IP). Este método es aprobado por tque American Veterinary Medical Association. </li><li> Cosecha de los pulmones y enjuagar dos veces con 1 x PBS para eliminar las células de la sangre. Recoge por un lado de los pulmones en un ml de helado de medio completo DMEM y mantener en hielo. Congelar rápidamente al otro lado de los pulmones y almacenar a -80 ° C para el examen de carga viral del ADN en los pulmones por qPCR (ver más abajo). </li><li> Use un homogeneizador de tejidos a fin de homogeneizar los tejidos del pulmón a la velocidad máxima durante 1 segundo, congelación y la descongelación tres veces. Lave el homogeneizador con etanol al 70% en cada paso cuando se cambia la muestra. </li><li> Centrífuga el tejido homogeneizado a 3.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante y la transferencia de nuevos tubos de ensayo en placa. </li><li> Prepare diluciones seriadas (generalmente de 10 ° a 10 -8) de las muestras de pulmón homogeneizado en 1,5 ml micro-tubos de centrífuga con DMEM normal por vórtice. Rellenar el número apropiado de tubos con 540 l DMEM y diluir 60 homogeneizado l en el primer tubo. Transferencia de 60 l del primer tubo ino el siguiente, y así sucesivamente. </li><li> Aspirar los medios de comunicación de las monocapas preparado Vero en placas de 12 pocillos y carga de 200 l / homogeneizado bien diluido en serie que contienen virus infecciosos en un orden inverso (de 10 -8 a 10 °). Use dos pocillos para cada titulación (por duplicado). </li><li> Se incuban las células Vero con el virus del inóculo de 1 hora a 37 ° C. Remover con suavidad las placas de cada 15 minutos para distribuir uniformemente el virus a través de la monocapa. </li><li> Eliminar el inóculo y reemplazarlo con 2 ml / pocillo de medio de recubrimiento (Tabla 1). Las placas se incuban durante una semana a 37 ° C. </li><li> Quitar medio de recubrimiento (no necesita ser completa) y sustituirlo por la solución / medio de tinción de la placa de ensayo (Tabla 1) y se incuba durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Cuando las placas se secan, contar el número de placas bien aisladas en cada dilución. Para minimizar el error, sólo los pozos que contienen entre 10 y 100 placas se cuentan. </li><li> Calcular el título del virus con los siguienala fórmula: título (UFP / ml) = [(número de placas / y) / (volumen de inóculo / y)] x factor de dilución. </li></ol> 4. Ensayo Centro infecciosas para determinar la carga del virus en los esplenocitos con infección latente <ol><li> Carga viral latente está determinado por el centro infecciosas (IC) de ensayo sobre la monocapa de células Vero. El día antes de las células IC ensayo de semillas, Vero en placas de 6 pocillos (1 -. 2.5 X 10 5 células / Por lo general, el uso de 11 pozos por muestra bazo, 10 pozos serán utilizados para la suspensión diluida en serie esplenocitos y un bien para la prueba una reactivación espontánea del virus después de ciclos hielo-deshielo. </li><li> Sacrificio de los ratones infectados después de la latencia se establece (12 - 14 días después de la infección). Cosecha del bazo del ratón y la piscina que en un ml de DMEM frío. </li><li> Disociación mecánica de bazo de ratón. La transferencia de los bazos de ratón recién aisladas en una placa de 10 cm y añadir 10 ml de medio deseado, tal como DMEM con FBS al 2%. Húmedo dos helados de gama de vidrio microscOpe diapositivas con helado de mediano plazo. Colocar el bazo en el lado poroso de una diapositiva y nick de la cápsula con el borde del extremo esmerilado de la otra guía. Mecánicamente se disocian del bazo entre dos diapositivas hasta que todos los grupos de color rojo son triturados (también eliminar las partículas de grasa si lo hay). </li><li> Lavar los portaobjetos con DMEM para recuperar las células restantes en los dos diapositivas. </li><li> Transferir la suspensión de todo el tejido suavemente a través de un colador de células (40 micras de malla de nylon) en un cónico de 50 ml con tapón de rosca del tubo. Lavar el plato de 10 cm que contiene los homogeneizados de bazo con 10 ml de PBS y la transferencia mientras que los filtros. </li><li> Se centrifuga la suspensión celular solo 10 minutos a 375 xg y desechar el sobrenadante. Flick los gránulos de las células para romper existentes grupos de células. Añadir 5 ml de tampón ACK (Tabla 1) para lisar los glóbulos rojos. Incubar 5 min y se centrifuga de nuevo a 375 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las pastillas, a fondo, pero suavemente, en PBS con FBS al 2%. Mantener a las células a 4 ° C. Use una pipeta paraeliminar los residuos, en su caso. Recuento de células viables mediante un contador de células automático (Bio-Rad). </li><li> Centrifugar el esplenocitos PBS-resuspendido en 375 g durante 4 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en DMEM 4 ml completa (2 x 1 ml se utilizará para el ensayo de IC de la suspensión original, 0,6 ml de serie utilizado para la dilución de cinco veces en el ensayo de IC, 0,4 ml de la preparación de ADN viral y qPCR, y 1 ml de suspensión se utilizará para evaluar una reactivación espontánea del virus latente después de tres ciclos de congelación y descongelación) </li><li> Prepara serie de cinco diluciones (es decir, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) de la suspensión de esplenocitos en los duplicados. Rellenar los tubos de 15 ml cónicos con 2,4 ml de DMEM y se diluye la suspensión de esplenocitos 600 l en el primer tubo y mezclar bien. Transferencia de 600 l de tubo anterior en el tubo que viene, etc No vórtice! </li><li> Aspirar el medio de los preparados de 6 y monocapa de células Vero. Semillas de 1 ml de esplenocitos en serie diluido en las células Vero con cada dilución DUPLicated (10 pozos se utilizará para 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 diluciones). </li><li> Incubar las placas 8-12 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. No exceda las 24 horas. Aspirar la suspensión de esplenocitos cabeza de serie y la carga de 4 ml superposición de los medios de comunicación (Tabla 1) a cada pocillo. Incubar durante 6 días. </li><li> Determinar los niveles de los centros de bazo infecciosas mediante la tinción de las placas con un 0,2% (w / v) de cristal violeta, como se muestra en la placa de ensayo. </li></ol> 5. La cuantificación del genoma viral <ol><li> Extraer el ADN genómico total de los tejidos γHV68 infectados, como el pulmón y el bazo muestras en este experimento. Utilice la sangre y DNeasy Tissue Kit (Qiagen), siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Determinar la concentración de ADN de cada muestra para asegurar la misma cantidad de ADN se utiliza para el ensayo qPCR. El diseño del virus de primers específicos (~ 200 pb de amplificación es el preferido para un ensayo qPCR). Se utilizó el γHV68 ORF56 primers específicos (cebador: 5 y prime; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 &#39;cebador inverso: 5&#39;-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3&#39;) para este ensayo y la actina β-primers (cebador: 5&#39;-cacccacactgtggcccatcat-3 &#39;cebador inverso: 5&#39;-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3&#39;) como un control de la reacción de PCR cuantitativa. </li><li> Mezclar la muestra de ADN (100 - 500 ng es bueno) y cebadores apropiados con 2 x SYBR maestro de la mezcla (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix). El uso del Bio-Rad en tiempo real del sistema PCR para cuantificar la carga viral en los tejidos infectados. Realizar PCR en las siguientes condiciones: 95 ° C durante 15 min y 45 ciclos de 95 ° C durante 30 min, 60 ° C durante 30 min y 72 ° C durante 30 minutos, seguido por análisis de las curvas de fusión, tanto para el virus y actina amplificados. </li><li> Para realizar una curva estándar para la cuantificación de genomas virales, diluir en serie de cantidades conocidas de un ADN γHV68 bácmido con el ADN genómico aislado de las células no infectadas. Ejecutar qPCR en paralelo con el ADN recuperado de la infecciónTed tejidos utilizando los mismos conjuntos de cebadores específicos del virus. </li><li> Presente la carga del genoma viral en los tejidos como el número de copias de ADN viral por unidad (por ejemplo, 100 ng o 500 ng) de ADN genómico tras la normalización de actina. </li></ol> 6. Los resultados representativos: La Figura 1 muestra el esquema general de los experimentos para la medición de γHV68 infección en ratones in vivo. Los resultados representativos de los títulos de virus en los pulmones durante la infección aguda de γHV68, según lo determinado por la placa de ensayo, se muestra en la Figura 2A. Una cepa mutante de γHV68 que contiene no funcional viral Bcl-2 (vBcl-2) replica a niveles comparables a los de tipo salvaje γHV68 en los pulmones después de 7 días de la infección intranasal de ratones Balb / c (6-7 ratones por grupo). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en los títulos de los pulmones de los virus fueron detectados entre los dos grupos. Estos datos indican que vBcl-2 no es un factor crucial para la infección aguda de γHV68 enratones. Sin embargo, después de la infección en un 28 días, el título de vBcl-2 del virus mutante en el bazo caído 6 - a 10 - veces en comparación con el WT, según lo medido por el ensayo de centro infecciosas (Figura 2B), lo que sugiere que la vBcl-2 mutante virus γHV68 fallas en el mantenimiento de la latencia del bazo después de la infección. De acuerdo con los títulos de centro infecciosa reduce la carga viral del genoma del virus mutante vBcl-2 se redujo drásticamente en comparación con la de los virus de PESO en el día 28 en repetidos experimentos, como se muestra en la Figura 2C. La estrecha correlación entre las cargas del genoma viral y la frecuencia de latente HV68vBcl-2 ex vivo virus mutante en la etapa de reactivación latente de la infección destaca un defecto de la latencia de la infección por el virus mutante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3472/3472fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema para la medición de γHV68 infección en los ratones a través de la formación de placa, un centro de infecciosos, y el ensayo qPCRs. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3472/3472fig2.jpg" /> Figura 2. Infección lítica y latente de la WT y mutantes γHV68 virus in vivo. La replicación aguda (A) de la WT y mutantes vBcl-2 γHV68 virus en los pulmones de los ratones Balb / c de 7 dpi (días después de la infección) se determinó por ensayo en placa. (B y C) del bazo centros infecciosas (B) y la carga del genoma viral (C) en el bazo de los ratones infectados se midieron a los 28 dpi mediante el ensayo de centro infecciosas y qPCR, respectivamente. Las líneas rojas, los promedios de los valores indicados. ns, no significativo.

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	<li>Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+activities+of+gammaherpesvirus+membrane+proteins.">Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins.</a> J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).</li><li>Stevenson, P. G., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+mechanisms+in+murine+gammaherpesvirus-68+infection.">Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection.</a> Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).</li><li>Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+murine+gamma-herpesvirus+infection+is+established+in+activated+B+cells,+dendritic+cells,+and+macrophages.">Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages.</a> J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).</li><li>Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+gammaherpesvirus+68+establishes+a+latent+infection+in+mouse+B+lymphocytes+in+vivo.">Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo.</a> J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).</li><li>Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+murine+gammaherpesvirus-68+transcription+during+lytic+and+latent+infection.">Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection.</a> J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).</li><li>Ganem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KSHV+and+the+pathogenesis+of+Kaposi+sarcoma:+listening+to+human+biology+and+medicine.">KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine.</a> J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).</li><li>Wen, K. W., Damania, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi+sarcoma-associated+herpesvirus+(KSHV):+molecular+biology+and+oncogenesis.">Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis.</a> Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).</li><li>E, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Bcl-2-mediated+evasion+of+autophagy+aids+chronic+infection+of+gammaherpesvirus+68.">Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68.</a> PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).</li><li>Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+gene+expression+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+B+lymphocytes.">Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes.</a> J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).</li><li>McCausland, M. M., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+technique+for+detecting+lymphocytic+choriomeningitis+virus+in+vivo.">Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo.</a> J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).</li><li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+regulate+murine+gammaherpesvirus+68+latency.">B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency.</a> J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).</li><li>Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+the+major+reservoir+of+latent+murine+gammaherpesvirus+68+in+peritoneal+cells.">Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells.</a> J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

γHV68 ha sido ampliamente utilizada como modelo para entender la patogénesis de los derechos humanos γ-VS 2,4,5. En este protocolo, se describen tres métodos de rutina utilizados, incluyendo la placa de ensayo para el título de virus infecciosos, ensayo de IC de la carga viral latente, y qPCR para la carga del genoma viral, para evaluar la infección aguda y latente de γHV68 después de la inoculación intranasal en ratones. La placa de ensayo se ha utilizado ampliamente par...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Procedimiento de preparación </td></tr><tr><td> Metilcelulosa (MC) superposición medio de ensayo de placa viral </td><td><ol><li> Calor ~ 250 ml de agua destilada en la botella TC a&gt; 80 ° C (hirviendo durante 3 minutos en el microondas) </li><li> Añadir poco a poco 2,5 g de polvo MC en agua caliente, revolviendo a fuego lento hasta que se disuelva. </li><li> Autoclave durante 15 minutos inmediatamente a un ciclo de líquido. </li><li> La agitación de la autoclave medios MC a 4 ° C durante la noche. </li><li> Combine 250 ml con 200 ml de medios MC 2 x MEM (Gibco-BRL) + 50 ml de FBS para dar 500 ml de medios de superposición. </li></ol></td></tr><tr><td> Fix / mancha por medio de la placa de ensayo </td><td> 0,2% (w / v) de cristal violeta en etanol al 20%. </td></tr><tr><td> Tampón de lisis ACK </td><td> NH 4 Cl 0,15 M, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM </td></tr><tr><td> DMEM completo </td><td> Dulbecco modificado de Eagle(DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS, Invitrogen), 2 mM L-glutamina, y el 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco-BRL). </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Específicas de medios utilizados en este protocolo <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> La ketamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> K2753 </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X1251 </td></tr><tr><td> Metilcelulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512-250g </td></tr><tr><td> 2 x MEM </td><td> Tecnologías de la Vida </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> Células colador </td><td> BD Faclon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Omni homogeneizador de tejidos </td><td> OMNI Internacional </td><td> TH115 </td></tr><tr><td> Sangre y DNeasy Tissue Kit </td><td> Qiageneración </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> IQTM SYBRH Green Supermix </td><td> BioRad </td><td> 170-8882 </td></tr><tr><td> CFX96 PCR en tiempo real del sistema </td><td> Bio-Rad </td><td> 184-5072 </td></tr><tr><td> Contador de células </td><td> Bio-Rad </td><td> 145-0001 </td></tr><tr><td> Sorvall SA-600 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 096-124022 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos y equipos específicos

measurement of &#947;hv68 infection in mice

γ-herpesvirus (γ-VS) se caracterizan por su capacidad para establecer infecciones latentes de las células linfoides 1. El rango de hospedadores de los derechos humanos γ-VS, como EBV y HVSK, ha obstaculizado seriamente los estudios detallados patógenos. Murinas herpesvirus γ-68 (γHV68) acciones amplias similitudes genéticas y biológicas con humanos γ-VS y es un patógeno natural de los roedores múridos 2. Como tal, la evaluación de γHV68 infección de ratones puras cepas en diferentes etapas de la infección viral constituye un modelo importante para la comprensión del ciclo de vida viral y patogenia en γ-VS infección. Tras la inoculación intranasal, γHV68 infección da lugar a una viremia aguda en el pulmón que luego resuelve en una infección latente de esplenocitos y otras células, que puede ser reactivado durante la vida del huésped 3,4. En este protocolo, se describe cómo utilizar la placa de ensayo para evaluartítulo de s virus infeccioso en el pulmón homogeneizado en monocapas de células Vero en la primera etapa (5-7 días) después de la infección intranasal (dpi). Mientras que la infección aguda es en gran parte aclaró 2-3 postinfección semana, una infección latente de γHV68 se establece alrededor de 14 dpi y mantenido posteriormente en el bazo de los ratones. La infección latente por lo general afecta a una población muy pequeña de células en los tejidos infectados, por el cual el virus permanece latente y se apaga la mayor parte de su expresión génica. Esplenocitos latente infectadas por el virus de reactivar de manera espontánea en explante en cultivo de tejidos, que puede ser recapitulado en un centro de infecciosos (IC) de ensayo para determinar la carga viral latente. A fin de estimar la cantidad de copias del genoma viral en la forma aguda y / o tejidos con infección latente, la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se utiliza para su máxima sensibilidad y precisión. El análisis combinado de los resultados de ensayo qPCR y la placa, y / o ensayo de IC se muestran los perfiles de espacio-temporal de los virusla replicación y la infectividad in vivo.

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Measurement of &amp;#947;HV68 Infection in Mice

γ-herpesvirus (γ-VS) establecer la persistencia de toda la vida en su huésped. La infección de ratones con γ-HV68 ofrece un manejable de forma genética<em&gt; En vivo</em&gt; Modelo para la caracterización del ciclo de vida / patogenia de γHVs. Este protocolo describe la detección y cuantificación de γHV68 infección en las fases aguda y después de la infección latente por la placa de formación, centro de infecciosos, y los ensayos de PCR cuantitativa.

La medición de γHV68 infección en los ratones

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

13.5K vistas.  University of Southern California, Los Angeles. γ-herpesvirus (γ-VS) establecer la persistencia de toda la vida en su huésped. La infección de ratones con γ-HV68 ofrece un manejable de forma genética En vivo Modelo para la caracterización del ciclo de vida / patogenia de γHVs. Este protocolo describe la detección y cuantificación de γHV68 infección en las fases aguda y después de la infección latente por la placa de formación, centro de infecciosos, y los ensayos de PCR cuantitativa.

Video: Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Investigación

Inmunología e Infección

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

Medición de la citosólica de Ca 2 + En aislados linfáticos contráctil

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D de imágenes multimodalidad<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Las infecciones en ratones

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

Inmunoterapia adoptiva de células iNKT en ratones RA inducidos por glucosa-6-fosfato (G6PI)

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body including at baseline. The precise role of chitinase is not known, however it was believed to play important role in digestion and host defense against chitin-containing food and pathogens, respectively. Recent work, including ours, has shown an important role of chitinase and chitinase-like proteins in host immunity and allergic diseases. Importantly, chitinase activities serve as important biomarkers of disease severity in a wide-range of diseases including type 2 inflammatory diseases such as asthma and pulmonary fibrosis. Similarly, patients with genetic disorders like Gaucher disease have significantly elevated chitinase levels, which not only correlate with disease severity but also serve as a reliable biomarker for therapeutic effectiveness. The protocol outlined here describes a simple, quick, and straightforward way to measure chitinase activity in BAL or serum samples of mice and can be widely adapted to human subjects and other model organisms due to the highly conserved nature of the enzymes.

Presented here is a simple method to measure chitinase activity in biological fluids such as bronchoalveolar lavage or serum.

Medición de la actividad de la chitinasa en muestras biológicas

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.