Wir danken Yutian Gan für die Verwendung von Abbildung 3. Diese Arbeit wurde vom National Science Foundation 0420971 unterstützt, die Smith College Blakeslee, Wilens und Holmes Fonds und dem Howard Hughes Medical Institute.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Verwenden Sie frische, schockgefroren oder RNAlater behandelten Gewebe von Mäusen als Ausgangsmaterial. Blot entfernt überschüssiges Konservierungsmittel mit einem Kimwipe bevor Sie fortfahren. </li><li> Entfernen Sie alle Sehnen und Faszien um die Muskel-und Hackfleisch, das Gewebe mit einschneidig Rasierklingen für 2 min auf gekühlten Glasplatten in einem kalten Raum (4 ° C), bis das Gewebe ist gut gehackt oder pulvrig. Sammeln Sie die Probe in einem vorher gewogenen Mikrozentrifugenröhrchen und bestimmen das Gewicht des Gewebes. Verwenden Sie nicht mehr als 10 mg des Gewebes als Ausgangsmaterial. </li><li> Add 45 ul Extraktionspuffer (8 M Harnstoff, 50 mM DTT, 4% CHAPS, 0,2% Trägerampholyte 5 / 8, 0,0002% Bromphenolblau) pro 1 mg zerkleinerte Gewebe, bei Raumtemperatur. Wenn das Volumen größer ist als 350 &amp;mgr; l, 350 &amp;mgr; l hinzufügen und homogenisieren zunächst (Schritt 1,4), dann den Rest des Puffers zu spritzen zu minimieren. </li><li> Homogenisieren des Gewebes sieben Mal mit einem motorisierten Stößel (Kontes Corp) für 15 Sekunden bei4 ° C, mit 2 Minuten auf Eis zwischen den einzelnen Homogenisierung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 15.600 xg für 30 Minuten bei 4 ° C. Speichern Sie den Überstand und messen das Volumen. Die Zelltrümmer Pellet wird verworfen. </li><li> Fällung der Proteine ​​im Überstand mit eiskaltem Reagenz-grade Aceton (3 mal v: v-Verhältnis). Beide Röhrchen für 15 Sekunden. Zentrifuge für 15.600 xg für 10 Sekunden, um Pellets zu bilden, und resuspendieren in Extraktionspuffer mit dem Kontes Motor-und Polypropylen-Rührstäbe (BioSpec Prod) </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.6. </li><li> Entweder mit Proteinkonzentration Schätzung der Proben gehen oder speichern Sie sie bei -20 ° C. </li></ol> 2. Protein-Konzentration Schätzung Verwenden Sie das Lowry-Assay 7 oder dem BCA-Assay 8 (Pierce); Ziel für etwa 4,5 mg ml -1. 3. Die isoelektrische Fokussierung <ol><li> Entfernen einer ReadyStrip IPG-Streifen (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)von -20 ° C und lassen Sie ihn bei RT für 10-15 min äquilibriert. </li><li> Vortex der Probe und Pipette 600-800 pg (Gesamtvolumen 200 mL) von Protein Probe in einer geraden Linie an der hinteren Kante des Kanals in der Probe Rehydratation Fach, so dass etwa 1 cm an jedem Ende. </li><li> Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Plastikabdeckung der IPG-Streifen - stellen Sie sicher, dass nur die Enden des Streifens Griff und vermeiden jeden Kontakt mit dem Gel. Beachten Sie die grundlegenden Ende des Streifens und positionieren Sie es auf der linken Seite des Fachs. Legen Sie die IPG-Streifen-Gel-Seite nach unten auf der Oberseite der Probe zu vermeiden Trapping Blasen darunter. Lassen Sie es eine Stunde rehydrieren. </li><li> Overlay mit 2,5 ml Mineralöl (BioRad). Decken Sie die Schale mit dem Deckel und lassen Sie über Nacht rehydrieren bei Raumtemperatur. </li><li> Ein Papier-Docht an beiden Enden der Schwerpunkt-Fach-Kanal und nass jeweils mit 10 l Millipore-Wasser. </li><li> Nehmen Sie IPG-Streifen und vertikal halten für etwa 10 Sekunden den Öl ablassen. Blot der Kunststoff-backing mit einem Kimwipe. </li><li> Legen Sie die IPG-Streifen Gel nach unten und mit grundlegenden Ende nach links in die Fokussierung Fach. Bedecken Sie den Streifen mit 2,5 ml Mineralöl. </li><li> Legen Sie das Fach in den PROTEAN IEF-Zelle (Bio-Rad) und Programmierung einer 3-Schritt-Protokoll (Tabelle 1) bei Standard-Zell-Temperatur von 20 ° C, einem maximalen Strom von 50 uA / Streifen und keine Rehydrierung Zeit. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Spannung </td><td> Zeit </td><td> Volt-Hrs </td><td> Rampe </td></tr><tr><td> Schritt 1 </td><td> 250 </td><td> 20 min </td><td></td><td> Linear </td></tr><tr><td> Schritt 2 </td><td> 8.000 </td><td> 2,5 h </td><td></td><td> Linear </td></tr><tr><td> Schritt 3 </td><td> 8.000 </td><td></td><td> 40.000 </td><td> Schnell </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td></td><td> 6,5 Std. </td><td> 40.000 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Drei-Schritt-Protokoll PROTEAN IEF-Zelle für 11 cm IPG-Streifen. </li><li> Nehmen Sie die IPG-Streifen aus dem IEF-Zelle mit einer Pinzette. Blot die Kunststoff-Abdeckung mit einem Kimwipe und Ort der IPG-Streifen-Gel nach oben in eine saubere Rehydratation Fach. Sie können decken die Rehydratation Tablett und wickeln Sie es mit Plastikfolie bedecken und bei - 80 ° C oder fortzufahren. </li></ol> 4. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese <ol><li> Übertragen Sie die Streifen (Gel-Seite nach oben) in einen 11 cm Equilibrierung Fach. </li><li> 4 mL Reduktion Puffer (6 M Harnstoff, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% Glycerin, 2% DTT), um den Kanal und Äquilibrierung der Streifen für 10 min mit einer leichten Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Reduktion Puffer, 4 ml Alkylierung Puffer (6 M Harnstoff, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% Glycerin, 2,5% iodoacetamide) und äquilibrieren der Streifen für 10 Minuten mit milden Schütteln. </li><li> Spülen Sie den IPG-Streifen durch Eintauchen des strip kurz in 1 X SDS Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,2). </li><li> Legen Sie den Streifen-Gel nach oben auf die Rückwand des 11 cm Criterion pre-cast 10,5% -14% Tris-HCl SDS-Polyacrylamidgel (Bio-Rad) und mit leichtem Druck, so dass er vollen Kontakt mit dem SDS-Gel macht; sicherstellen, dass keine Luftblasen zwischen den beiden Geloberflächen gefangen sind. </li><li> Overlay der IPG-Streifen mit 1 ml geschmolzene Agarose-Lösung (0,5% Agarose, 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, Bromphenolblau) und lassen Sie die Agarose für 5 Minuten erstarren. </li><li> Legen Sie 5 ul Protein-Marker 10-225 kDa (USB, P / N: 76.740) in den einzelnen sowie Molekulargewicht-Standards. </li><li> Führen Sie das Gel in SDS-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,2) bei 200 V bei Raumtemperatur oder in einem kalten Raum (4 ° C) mit Hilfe der Bromphenolblau Farbstoff vor der Migration auf die Elektrophorese zu überwachen. </li><li> Entfernen Sie das Gel aus dem Plastikbehälter gegossen und Flecken über Nacht unter leichtem Schütteln in Coomassie Brilliant BlueR-250-Färbung (45,5% Methanol, 45,5% dH2O, 9,0% Essigsäure, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250). </li><li> Schütteln Sie das Gel in Entfärben 1-Lösung (45,5% Methanol, 45,5% dH 2 O, 9,0% Essigsäure) zweimal für jeweils 3 Stunden und in Entfärben 2 (5% Methanol, 90% dH 2 O, 5% Essigsäure) über Nacht. Bewahren Sie das Gel in 7% Essigsäure für die Analyse. </li></ol> 5. Gel Imaging und Analyse <ol><li> Machen Sie Bilder der Gele mit der Quantity One-Software-Programm, das VersaDoc Imaging-System (BioRad) betreibt. Schneiden Sie das Bild Bereichen einheitlich für alle Gele in Ihr Experiment. </li><li> Laden Sie das beschnittene Bilder auf der PDQuest 8.0 Software-Programm, ein Experiment zu erstellen. Folgen Sie dem Experiment Setup-Assistenten, um die Parameter für Spot-Erkennung und Spotmatching über die Gele zu definieren. Überprüfen und verfeinern die Stelle passenden Ergebnisse manuell, wenn nötig. </li><li> Führen Sie quantitative und statistische Analyse der Gele angepasst Proteinspots mit tw erkenneno-fach oder höher statistisch signifikanten Unterschiede in der Expression zwischen den beiden Gruppen Gel. Erstellen Sie eine Analyse mit diesen Stellen von Interesse setzen und schneiden Sie sie mit einem EXQuest Spot Cutter (BioRad) für Trypsinverdauung und LC-MS-basierten Protein-Identifizierung. </li></ol> 6. In-Gel-tryptischen Verdau Für diesen Schritt eine modifizierte Pierce In-Gel Tryptic Digest Kit (# 89871X, Pierce)-Protokoll verwendet wird. <ol><li> Geben Sie 200 ul der Entfärbelösung (25 mM Ammoniumhydrogencarbonat, 50% Acetonitril) auf das Gel Stecker. Vortex und Inkubation der Proben bei 37 ° C für 30 Minuten unter Schütteln. Entfernen und entsorgen Sie die Lösung. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6.1. </li><li> Add 30 ul frisch zubereiteten reduzierendem Puffer (50 mM Tris [2-carboxy] Phosphin, 22,5 mM Ammoniumhydrogencarbonat), um die Rohre mit dem Gel-Stecker und Inkubieren bei 60 ° C für 10 Minuten. </li><li> Die Proben zu kühlen, dann entfernen und die Verringerung der Puffer.</li><li> Add 30 ul Alkylierung Puffer (100 mM iodoacetamide, 20 mM Ammoniumhydrogencarbonat, unmittelbar vor der Verwendung in Folie Röhrchen vorbereitet. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die Alkylierung Puffer. Waschen Sie die Gel-Stecker durch Zugabe von 200 ul der Entfärbelösung in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 15 Minuten. </li><li> Entfernen und Entsorgen der Entfärbelösung und wiederholen Sie die Wäsche. </li><li> Add 50 ul Acetonitril auf das Gel Stecker und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur, damit sie zu schrumpfen trocken, dann vorsichtig den Acetonitril. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6,8 Mal mehr. Gel Stücke aussehen soll weiß und klein. </li><li> Lassen Gelstücke in einem CentriVap Concentrator (Labconco, Model EX1245) für 10 Minuten trocknen lassen. </li><li> Swell Gel Stücke durch Zugabe von 10 ul der aktivierten Trypsin-Lösung (10 ng / ul Trypsin, 25 mM Ammoniumhydrogencarbonat). Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 minuten. </li><li> Add 25 ul Verdauung Puffer (25 mM Ammoniumhydrogencarbonat), um die Rohre. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur unter Schütteln. </li><li> Beschallen die Proben für 10 Minuten (Branson, Ultraschallbad Modell 2510) und Spin sie nieder, bevor Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Speichern Sie den Überstand. </li><li> Zur weiteren Auszug Peptide, mit 10 &amp;mgr; l 0,1% iger Ameisensäure und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln. Beschallen die Proben für 10 Minuten, den Überstand und verbinden sich mit gespeichert Überstand in Schritt 6.13. </li></ol> 7. Microscale Entsalzung von Peptid-Extrakte <ol><li> Entfernen Ammoniumbicarbonat und andere Salze in der Peptid-Extrakte mit Hilfe von PepClean C-18 Spin Columns (ThermoFisher) nach Anweisungen des Herstellers. </li><li> Eluieren Peptide zweimal mit je 20 ul 70% Acetonitril, verdunsten die Proben trocken durch Zentrifugation in der CentriVap Concentrator für 1 Stunde und resuspendierendie Peptide in 10 ul 0,1% Ameisensäure für MS-Analyse. </li></ol> 8. Protein Identifikation mittels HPLC-gekoppelte Massenspektrometrie <ol><li> Separate 5 ul der Peptidmischung auf einem Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) über 40 Minuten, mit einem linearen 2-50% Acetonitril-Gradienten mit 0,2% iger Ameisensäure auf einer Pepswift monolithischen PS-DVB-Säule (Dionex), um eine Nanospray gekoppelt I Quelle auf eine Ionenfallen-Massenspektrometer (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) bei einer Flussrate von 400 nl / min an der Spitze. </li><li> Detect-Peptid MS1 Signale zwischen 400 bis 1400 m / z und lassen für die 3 stärksten Ionenpeaks für MS2 Sequenzierung von CID mit dynamischen Ausschluss isoliert werden. </li><li> Für Protein-Identifizierung, Analyse der Peptid-Ergebnisse über eine Sequest Maus Referenzdatenbank Suche (BioWorks Software, Thermo-Fisher Scientific) mit einer statischen alkylierten Cystein Modifikation und dynamische Änderungen für die Phosphorylierung (Serin, Threonin, Tyrosin), Methylierungnung (Histidin), Oxidation (Methionin), ADP-Ribosylierung (Arginin) und N-terminale Acetylierung. Übernehmen konservativen Matching-Kriterien (zB Peptid-Toleranz auf 2 AMU und 1,00 Fragment Toleranz, Proteine ​​enthalten mindestens 2 Peptide Übergabe eines Xcorr vs Charge State-Filter [z = 1 / x = 1,5, z = 2 / x = 2,00, z = 3 / x = 2,50, z = 4 / x = 3,00] und einer Wahrscheinlichkeit von p &lt;0,05) 5 und manuell überprüfen Sie die MS-Spektren für die selbstbewusste Identifizierung von Proteinen. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse: Männliche und weibliche unexercised wurde murinen Skelettmuskel (Bizeps) extrahiert und in eine zweidimensionale Karte 5, die erste Stufe des Muskels vergleichenden Proteomanalyse (Abbildung 2). Sobald visualisiert mittels hochauflösender Digital Imaging, ca. 800 Proteinspots wurden in jedem erkannt. Die männliche Proteom Karte als Grundlage, ist es klar, dass es zahlreiche Punkte, die in Hülle und Fülle Veränderung in der weiblichen Proteom. Der Spot-Intensitäten werden<html> Maßnahmen der Veränderung des entsprechenden Proteins Mengen (Abbildung 3). Die Identität der Protein-Spots, die mehr als zwei-fach (nach oben oder unten) zu ändern und sind statistisch signifikant (p &lt;0,05) mit einem n = 5 Mäusen werden durch Aminosäure-Sequenz-Analyse mit Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie ermittelt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Frauen eine Fülle Rückgang der Zucker Energiestoffwechsel Enzyme und der Kreatinkinase-Enzym (CK)-Isoformen, eine andere Energieversorgung in den Muskeln zu demonstrieren. Mensch und Tier Display höhere männliche Serum CK-Werte in Ruhe und nach dem Training 9,10, aber CK-Werte nicht unbedingt mit der Höhe der myofibrillären Störung 11,12 korrelieren. Diese geschlechtsspezifischen Dimorphismus in der zellulären Fülle von CK in murine biceps brachii ist ein neuartiges finding5 und kann die physiologisch verschiedene CK-Werte zu beantworten. Fakten: g1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Eine allgemeine Schema des Protokolls für die vergleichende Proteomik. ; Analyse von Proben, und Identifizierung von Proteinen Probenvorbereitung: Das Protokoll ist in drei Gruppen unterteilt. Die Enden jeder dieser drei Gruppen von Protokollen sind auch angemessene Pausen Orten, obwohl die besten Ergebnisse sammelte werden, wenn die gesamte Protokoll wird ohne Unterbrechung durchgeführt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vergleich der weiblichen Maus Bizeps Proteinspots gegenüber der identischen Stellen im männlichen Bizeps (grüne Kreise o). Spots, die größer oder gleich zweifach bei Frauen erhöht werden eingekreist rot (o) und diejenigen, die weniger als oder gleich zweifach zurückgegangen sind eingekreist blau (o). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" /> Abbildung 3 Gel Spot Intensity Analysis:. X-Achse, weiblichvor dem Training (Kontrollgruppe, n = 5); Y-Achse, weiblich einzigen Kampf 0 Std. Zeitpunkt Gruppe (n = 5). Regressionsgerade: Korrelationskoeffizient = 0,919; Steigung = 0,976; abzufangen = -0,0293. Spots über der roten Linie und unterhalb der blauen Linie zu ändern mehr als + / - zwei-fach.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die LC / MS Proteomik hier vorgestellte Methode ist eine sehr zuverlässige und reproduzierbare Protokoll für eine schnelle Analyse der ersten Ebene der Skelettmuskulatur Proteom. Es ermöglicht eine einigermaßen sinnvoll Vergleich der Besonderheiten der Geschlechter. Low Fülle Proteine ​​würde eine Fraktionierung des Muskels Probe, da viele der kontraktilen Proteine ​​wie möglich zu entfernen, wodurch die geringe Häufigkeit Proteine. Tailoring des Proteoms Profil kann mit unterschiedlichen pH-Bereich IPG-Streifen und alternative Prozentsatz Gradientengele erreicht werden, wenn gewünscht. Mehr empfindliche fluoreszierende Flecken vorhanden sind, aber wir empfehlen, dass jedes Labor die Linearität dieser Flecken in Ihr System zu bestimmen. Für eine genauere Analyse der Proteinexpression der DIGE System (zweidimensionale In-Gel-Elektrophorese-System von GE Healthcare Life Sciences) verwendet werden kann, aber das bedeutet fügen Sie eine Ebene der Komplexität der Methodik. Darüber hinaus kann das Protokoll beschrieben mit den meisten ani verwendet werdenmal Geweben, für die ein Genom sequenziert wurde, sowie de novo Sequenzierung eines Proteins aus einer beliebigen Quelle, solange es sich auf einem zweidimensionalen Gel aufgelöst werden, da überlappende enzymatische Fragmente können unter Verwendung von hochreinen Enzymen zusätzlich werden zu Trypsin. Proben aus anderen Quellen Gewebe erfordern einige Änderungen in der Gewinnung Methodik, vor allem, wenn auf der Suche nach Membran und hydrophobe Proteine, aber wir hatten gute Ergebnisse mit diesem Protokoll mit Herz-, Leber-, Nieren-und Hirngewebe zu haben. Andere post-translationale Modifikationen kann durch Modifikation des Massenspektrums Datenbank Suchkriterien erkannt werden. In Summe haben wir eine recht ausführliche ersten Protokoll für Proteom-Profiling-Analyse vorgestellt.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Typ </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> PepClean C-18 Spin Columns </td><td> Verbrauchsmaterial </td><td> ThermoFisher Wissenschaftlich </td><td> PI-89870 </td><td></td></tr><tr><td> Pepswift monolithischen Spalte (100um x 5 cm) </td><td> Verbrauchsmaterial </td><td> Dionex </td><td> 162348 </td><td></td></tr><tr><td> Criterion pre-cast 10,5% -14% Tris-HCl SDS Polyacrylamidgelen </td><td> Verbrauchsmaterial </td><td> BioRad </td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> Readystrip IPG-Streifen </td><td> Verbrauchsmaterial </td><td> BioRad </td><td> Unterschiedliche pH reicht </td><td></td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> A465-1 </td><td></td></tr><tr><td> Aceton </td><td> Reagens </td><td> Pharmco </td><td> 329000 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reagens </td><td> BioRad </td><td> 163-2111 </td><td> Auflage Lösung </td></tr><tr><td> Ammoniumbicarbonat </td><td> Reagens </td><td> Fluka </td><td> 40867 </td><td></td></tr><tr><td> Bromphenolblau </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Lyte Ampholyte </td><td> Reagens </td><td> BioRad </td><td></td><td> Unterschiedliche pH reicht </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Reagens </td><td> USB </td><td> 13361 </td><td></td></tr><tr><td> Commassie Blau R-250 </td><td> Reagens </td><td> ThermoFisher Wissenschaftlich </td><td> 20278 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> Reagens </td><td> USB </td><td> 15395 </td><td></td></tr><tr><td> Ameisensäure </td><td> Reagens </td><td> ThermoFisher Wissenschaftlich </td><td> 28905 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td> Reagens </td><td> USB </td><td> 16407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Iodacetamid </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Reagens </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td> Mineralöl </td><td> Reagens </td><td> BioRad </td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-Base </td><td> Reagens </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93349 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [2-carboexyethyl] Phosphin </td><td> Reagens </td><td> ThermoFisher Wissenschaftlich </td><td> 77720 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin Endoproteinase, TPCK behandelt, MS grade </td><td> Reagens </td><td> Durchstechen </td><td> 90055 </td><td> geändert </td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> Reagens </td><td> USB </td><td> 75826 </td><td></td></tr><tr><td> Wasser </td><td> Reagens </td><td> Burdick &amp; Jackson </td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> CentriVap Concentrator </td><td> Tool </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquest Ort cutter </td><td> Werkzeug </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LCQ Deca XP Max-Ionen Trap-Massenspektrometer </td><td> Werkzeug </td><td> ThermoFisher Wissenschaftlich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Motorisierte Pistill </td><td> Werkzeug </td><td> Kontes Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polypropylen Rühren </td><td> Werkzeug </td><td> BioSpec Prod </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stangen </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PROTEAN IEF Zelle </td><td> Werkzeug </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Werkzeug </td><td> Branson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Surveyor Plus-HPLC System </td><td> Werkzeug </td><td> ThermoFisher Wissenschaftlich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDoc Bildgebung System </td><td> Werkzeug </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skeletal muscle gender dimorphism from proteomics

Gross Kontraktion im Skelettmuskel vor allem durch eine relativ kleine Anzahl von kontraktilen Proteinen bestimmt, aber dieses Gewebes ist auch bemerkenswert anpassungsfähig auf Umweltfaktoren 1 wie Hypertrophie durch Krafttraining und Atrophie durch Nichtgebrauch. Es zeigt dabei Umbau und Anpassungen an Stressoren (Hitze, Ischämie, Schwermetalle, etc.) 2,3. Schäden können zu Muskel durch einen Muskel Kraftaufwand auftreten, während die Verlängerung der sogenannten exzentrischen Kontraktion 4. Die kontraktilen Proteine ​​können in solche Anstrengungen beschädigt und muss repariert, abgebaut und / oder resynthetisiert werden; diese Funktionen sind nicht Bestandteil der kontraktilen Proteine, sondern auch von anderen viel weniger reichlich Proteine ​​in der Zelle. Um festzustellen, welche Gruppe von Proteinen in die Verbesserung der diese Art von Schäden handelt, muss eine globale Proteomanalyse vor hergestellt werden bis 5 ausüben und dann folgte im Anschluss an die Übung, um das Differential zu bestimmenProteinexpression und damit Highlight Kandidaten-Proteine ​​in der Anpassung an Schäden und deren Reparatur. Darüber hinaus haben die meisten Studien der Skelettmuskulatur auf die Männchen der Gattung durchgeführt und kann daher nicht repräsentativ für die weibliche Muskulatur werden. In diesem Artikel präsentieren wir eine Methode zur Extraktion von Proteinen reproduzierbar aus männlichen und weiblichen Muskeln und trennt sie durch zweidimensionale Gelelektrophorese durch hochauflösende digitale Bildbearbeitung 6 an. Dies bietet ein Protokoll für die Spots (und in der Folge identifizierten Proteine), die zeigen eine statistisch signifikante (p &lt;0,05) zweifache erhöhen oder zu verringern, erscheinen oder verschwinden aus dem Schaltzustand. Diese werden dann ausgeschnitten, mit Trypsin verdaut und getrennt durch Hochdruck-Flüssigchromatographie gekoppelt mit einem Massenspektrometer (LC / MS) für die Identifizierung von Proteinen (LC / MS / MS) 5. Diese Methode (Abbildung 1) kann auf vielen Geweben mit wenig bis gar keine Modifikation verwendet werden (Leber, Gehirn, hörent etc.).

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Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Eine geradlinige Reihe von Methoden zur Isolierung und Bestimmung der Identität der am häufigsten vorkommenden Proteine ​​in der Skelettmuskulatur exprimiert. Etwa 800 Plätze sind auf einem zweidimensionalen Gel aus 10 mg Muskel zu erkennen, dies ermöglicht die Bestimmung des Geschlechts-spezifische Protein-Expression. Diese Methoden werden gleichwertige Ergebnisse in den meisten Geweben.

Skeletal Muscle Gender Dimorphismus von Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K Aufrufe.  Smith College. Eine geradlinige Reihe von Methoden zur Isolierung und Bestimmung der Identität der am häufigsten vorkommenden Proteine ​​in der Skelettmuskulatur exprimiert. Etwa 800 Plätze sind auf einem zweidimensionalen Gel aus 10 mg Muskel zu erkennen, dies ermöglicht die Bestimmung des Geschlechts-spezifische Protein-Expression. Diese Methoden werden gleichwertige Ergebnisse in den meisten Geweben.

Serie: Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-mechanischen Analyse von isolierten Skelettmuskel

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Forschung

Medizin

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. Although originally developed and used extensively in the rat due to its larger size, the tibial nerve in mice is big enough that it can be easily manipulated with either crush or transection, leaving the peroneal and sural nerve branches of the sciatic nerve intact and thereby preserving their target muscles. Thus, this model offers the advantages of inducing less morbidity and impediment of ambulation than the sciatic nerve transection model and also allows investigators to study the physiologic, cellular and molecular biologic mechanisms regulating the process of muscle atrophy in genetically engineered mice. The tibial nerve supplies the gastrocnemius, soleus and plantaris muscles, so its transection permits the study of denervated skeletal muscle composed of fast twitch type II fibers and/or slow twitch type I fibers. Here we demonstrate the tibial nerve transection model in the C57Black6 mouse. We assess the atrophy of the gastrocnemius muscle, as a representative muscle, at 1, 2, and 4 weeks post-denervation by measuring muscle weights and fiber type specific cross-sectional area on paraffin-embedded histologic sections immunostained for fast twitch myosin.

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of skeletal muscle atrophy. The model surgical protocol is described and demonstrated in C57Black6 mice. &#160;

Tibialisnerv Durchtrennung - ein standardisiertes Modell für Denervation-induzierte Skelettmuskelatrophie in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&amp;#246;m Technique

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Menschlichen Skelettmuskelbiopsie Verfahren unter Verwendung der modifizierten Technik Bergström

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

Quantitative Magnetresonanztomographie von Skelettmuskelerkrankung

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Mensch<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; Skeletal Muscle Biopsy die Weil-Blakesley Conchotom Verwendung

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

Induktion und Beurteilung der belastungsSkelettMuskelSchäden beim Menschen

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Phosphor-31 Magnet-Resonanz-Spektroskopie: Ein Werkzeug zur Messung<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxidative Phosphorylierung Kapazität im menschlichen Skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of myosin heavy chain (MyHC) isoforms has emerged as a finer discriminator of fiber-type. Type I, type IIA, type IIX and type IIB fibers can now be identified with precision based on their MyHC profile; however, manual analysis of these data can be slow and down-right tedious. In this regard, rapid, accurate assessment of fiber-type composition and morphology is a very desirable tool. Here, we present a protocol for state-of-the-art immunohistochemical staining of MyHCs in frozen sections obtained from mouse hindlimb muscle in concert with a novel semi-automated algorithm that accelerates analysis of fiber-type and fiber morphology. As expected, the soleus muscle displayed staining for type I and type IIA fibers, but not for type IIX or type IIB fibers. On the other hand, the tibialis anterior muscle was composed predominantly of type IIX and type IIB fibers, a small fraction of type IIA fibers and little or no type I fibers. Several image transformations were used to generate probability maps for the purpose of measuring different aspects of fiber morphology (i.e., cross-sectional area (CSA), maximal and minimal Feret diameter). The values obtained for these parameters were then compared with manually-obtained values. No significant differences were observed between either mode of analysis with regards to CSA, maximal or minimal Feret diameter (all p &#62; 0.05), indicating the accuracy of our method. Thus, our immunostaining analysis protocol may be applied to the investigation of effects on muscle composition in many models of aging and myopathy.

Immunohistochemical staining of myosin heavy chain isoforms has emerged as the state-of-the-art discriminator of skeletal muscle fiber-type (i.e., type I, type IIA, type IIX, type IIB). Here, we present a staining protocol along with a novel semi-automated algorithm that facilitates rapid assessment of fiber-type and fiber morphology.

Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic demand. Reactive hyperemia (in response to a brief period of tissue ischemia) is an independent predictor of cardiovascular events and provides important insight into vascular health and vasodilatory capacity. Skeletal muscle oxidative capacity is equally important in health and disease, as it determines the energy supply for myocellular processes. Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess each of these major clinical endpoints (reactive hyperemia, neurovascular coupling, and muscle oxidative capacity) during a single clinic or laboratory visit. Unlike Doppler ultrasound, magnetic resonance images/spectroscopy, or invasive catheter-based flow measurements or muscle biopsies, our approach is less operator-dependent, low-cost, and completely non-invasive. Representative data from our lab taken together with summary data from previously published literature illustrate the utility of each of these end-points. Once this technique is mastered, application to clinical populations will provide important mechanistic insight into exercise intolerance and cardiovascular dysfunction.

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with &#039;One Stop Shop&#039; Near-infrared Spectroscopy

Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia, neurovascular coupling and skeletal muscle oxidative capacity in a single clinic or laboratory visit.

Skelettmuskulatur neurovaskuläre Kopplung, Oxidative Kapazität und mikrovaskuläre Funktion mit "One Stop Shop" Nah-Infrarot-Spektroskopie

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...