これは、コアラファーからグルココルチコイドホルモン、コルチゾールの評価のための新しい方法です。コアラの慢性ストレスの評価のための新しいバイオマーカーを提供します。この技術の主な利点は、サンプル調製とホルモンアッセイの間にかなり速いターンアラウンドタイムを有する非常に敏感で再現性の高い方法である点である。
この技術は、非常に有用な臨床管理ツールであるコアラの慢性ストレスの定量的評価を可能にする。この手順を手伝ってくれるのは、私の研究室の卒業生であるディラン・フォックスです。この手順を開始するには、マイナス80°Cで貯蔵から毛皮を取り出し、室温で解凍させます。
次に、実験室の分析精度バランスで毛皮の重量を量る。ファーの60ミリグラムを事前に計量し、1.5ミリリットル遠心管にラベル付けし、18チューブが満たされるまでこれを繰り返します。ピペットを使用して、各チューブに100%HPLCグレードのイソプロパノールを1ミリリットル加えます。
30秒間サンプルを渦出します。液体と毛皮の分離を達成するために0.5ミリリットルのマイクロ精密ふるいで各サンプルをひずみ、液体を廃棄物容器に捨てます。各毛皮のサンプルをラベル付きプラスチック製の計量ボートに入れる。
その後、計量ボートを真空デシケータに入れ、毛皮を乾燥させるために3日間放置します。毛皮が完全に乾燥したら、各サンプルをラベル付きの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れる。各サンプルを3つのクロムスチールビーズを入れたビーズミルに入れ、毎秒30回揺れで2分間粉砕します。
100%分析グレードメタノールと100%分析グレードイソプロパノールで、18本の全管が充填されるまでこの転写を繰り返します。この後、ピペットを使用して、最初の抽出技術の1ミリリットルを毛皮サンプルを含む6つの1.5ミリリットル遠心分離管に移します。各チューブをキャップし、シェーカーを使用して室温で少なくとも12時間脈動してインキュベートします。
その後、0.5ミリリットルのマイクロ精密ふるいでサンプルをひずみます。ピペットを使用して、毛皮が適切に廃棄されることを確認しながら、新しいラベルの1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに液体を移します。ヒュームフードでは、窒素蒸気の流れの下で溶媒抽出物を完全に試してみてください。
次いで、400マイクロリットルのアッセイバッファーと100%分析グレードエタノールの100マイクロリットルで乾燥したサンプルを再構成する。コントロールを作成するには、まずストレータへの既知の露出を持つ動物からサンプルを選択します。抽出プールを作るために、200マイクロリットルの総容量が得られるまで、各サンプルから20マイクロリットルの抽出物を取ります。
抽出プールをマイナス80°Cで保管し、アッセイを実行する準備が整うまで保管します。準備ができたら、コルチゾール標準に対する抽出物の並列処理グラフから30%および70%の結合点の希釈係数を取得し、サンプルプールを適切に希釈して高低コントロールを作成するためにアッセイバッファーを使用します。市販のコルチゾールキットを使用して、サプライヤーの指示に従って、サンプル、コントロール、コルチゾール標準、非特異的結合井戸、最大結合井戸を含む96ウェルストリッププレートを設置しました。
キットの小冊子に含まれるプレートレイアウトシートを使用して、サンプル、コントロール、標準の位置をリストします。次に、前述したファーホルモン抽出プロセスに従って、100%メタノール抽出コアラファーを得る。メーカーの指示に従ってコルチゾールキットの試薬を準備します。
ピペット50マイクロリットルのサンプルまたは標準はプレートの井戸に入る。ピペット75マイクロリットルのアッセイバッファーを非特異的結合ウェルに、そして50マイクロリットルのアッセイバッファーを最大結合ウェルに入れます。リピーターピペットを使用して、各ウェルにコルチゾールコンジュゲートの25マイクロリットルを追加します。
次いで、非特異的結合ウェルを除き、コルチゾール抗体のピペット25リットルを各ウェルに入れます。プレートの側面を軽くタップして、試薬が十分に混合されていることを確認します。プレートシーラーでプレートを覆い、軌道シェーカーを使用して室温で1時間振ります。
この後、プレートシールを取り外し、300マイクロリットルの洗浄バッファーを4回洗浄してウェルプレートを吸引した。その後、きれいな吸収性タオルでそれをタップしてプレートを乾燥させます。ピペット100マイクロリットルのテトラメチルベンジジン基質を各ウェルに。
プレートシーラーをウェルプレートに置き、室温で30分間インキュベートします。この後、各ウェルに50マイクロリットルのストップ溶液をピペットします。プレートを450ナノメートルを読み取ることができるプレートリーダーに移し、テキストプロトコルで概説されているように最終的なホルモン濃度を計算します。
本研究では、対象となるホルモン代謝産物のエッセイ検出は、並列性を用いて決定される。並列曲線上では、50%の結合点によって、標準曲線のサンプル希釈係数が決まります。ご覧のように、100%エタノールおよび100%イソプロパノール抽出物は、コルチゾール標準に対して平行変位を提供しなかった。
しかし、100%メタノール抽出物はコルチゾール標準に対して平行変位を提供する。イントラアッセイと相互アッセイの変動係数は、すべてのアッセイで実行される高結合および低結合サンプル抽出から決定されます。低結合の内部制御はきちんとしたコアラ抽出プールと見られ、高結合の内部制御は1対2の希釈コアラ抽出プールであると見られる。
各溶媒抽出物とコルチゾール標準との関連は、回帰プロットを用いて決定される。100%メタノール抽出物は、100%エタノールおよび100%イソプロパノール抽出物と比較して、最高のR二乗値を持つ回帰の最良の線を提供します。ステロイドホルモンの損失を避けるためにサンプルを粉砕する前に、サンプルの洗浄ステップを実行する必要があることを覚えておくことが重要です。.
この手順に従って、我々は他のステロイドホルモンを測定することができます, コアラのストレスと生殖との相互作用を見るために生殖ホルモンなど.この技術は、保全生理学の新しい分野のための新しいツールを提供し、コアラファーのコルチゾールの非侵襲的評価を可能にする。市販のコルチゾールキットは、少量の試薬を提供します。
しかし、この実験室の手順を行っている間、自分自身への傷害を最小限に抑えるために個人的な保護具を着用することが重要です。
