我々は、モノクローナル抗体CR9114のためにパトリックC.ウィルソンに感謝したいと思います。我々はまた、元のA/Anhui/1/13のプラスミドについてジェニファーDebeauchampとリチャードウェビーに感謝します。この仕事のための部分的なサポートは、アレルギーのための国立感染症研究所が資金提供プログラムプロジェクト無償AI097092-01A1とCEIRS（インフルエンザ研究および監視のためのセンター·オブ·エクセレンス、HHSN26620070010C）によって提供された。 FKは、オーストリア科学基金（FWF）からアーウィンシュレーディンガーの交わり（J 3232）によってサポートされていました。

1。組換えバキュロウイルスの生成<ol><li>バキュロウイルストランスファープラスミドへのクローニング<ol><li>クローンH7 HAと修正されたpFastBac転送プラスミドにN9のNA外部ドメイン（または他のHAまたはNA遺伝子）（紹介を参照してください）​​。 HAのC末端三量体化ドメインおよびヘキサヒスチジンタグを含有するため、並びにNAはN-末端四量体化ドメインおよびヘキサヒスチジンタグを含有するためのベクターは、1,10,11,22（ 図1）が記載されているから要求することができ作者。 説明文：HA外部ドメインは、三量体化ドメインなしで発現が特にストークドメイン、立体配座中和エピトープの喪失をもたらす、誤って折り畳まれます。同様に、NAの酵素機能は、適切な四量に依存しています。 </li><li>バクミドの生成 バキュロウイルス発現を使用して応じDH10Bacコンピ細菌にHAおよびNA遺伝子を含むバキュロウイルストランスファープラスミドを変換製造者の指示に従ってシステム。単離し、製造業者の指示（ 図2）に係るミディプレップキットを用いてバクミドを精製する。 </li></ol></li><li>タンパク質発現の組換えバキュロウイルスおよび検証の救助 説明文：次の手順は、層流フード内で無菌的に実行されなければならない。 HAおよびNA（または関心のある他の遺伝子）に独立して、この手順を実行します。昆虫細胞は、通常、CO 2せずに28℃で増殖させる。このプロトコルのSf9細胞を、他に示されない場合、10％FBS、1％ペニシリン-ストレプトマイシン*および0.1％プルロニックF68溶液を補充した完全TNM-FH昆虫細胞培地中で増殖させ、1週間に2回、1:4に継代する。ハイファイブ細胞はSFXの無血清培地中で増殖させ、週二回1:15継代する。 *抗生物質を添加すると、プロトコル全体オプションとみなされ、各研究室で使用される慣習に従って調整する必要があります。 <ol><li> 2×10 5細胞/ cm 2の密度で6ウェルプレート中のプレートSf9昆虫細胞（CO 2なし）28℃のインキュベーター内に20分間放置。 </li><li>ミックス2μgのTNM-FH培地（無血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン）100μlの組換えバクミドの（濃0.5-2μgの/ UL）。 TNM-FH培地（無血清、ペニシリン - ストレプトマイシン）100μlのトランスフェクション試薬の6μLを混ぜる。 2ボリュームを兼ね備​​え、穏やかに混合し、室温（トランスフェクション混合物）で20分間放置します。コントロール（ 図3）のように1モックトランスフェクションが含まれています。 </li><li> （細胞は今板に固執する）およびペニシリン - ストレプトマイシン（1％）を含む無血清TNM-FH培地2mlで交換してメッキSf9細胞からの上清を取り除きます。 （ステップ1.2.2からの）トランスフェクション混合物の完全なボリュームを追加し、5秒間、慎重に6ウェルプレートを揺する。 6時間（ 図3）のために、CO 2なしで28℃のインキュベーターで培養する。 </li><li>メディアWIを交換してください目の新鮮な完全TNM-FH培地（10％FBS、1％ペニシリン - ストレプトマイシンおよび0.1％プルロニックF68を含む）。 6日間、CO 2のない28℃のインキュベーター内でインキュベートする。顕微鏡下で、時折細胞を確認してください。感染した細胞は通常、丸く大きな表示される核を拡大しており、（ 図4）を分離するために開始します。 </li><li>細胞およびタンパク質発現の確認の収穫<ol><li>室温で5分間、2,000×gで遠心分離により細胞を回収し6日後、トランスフェクション。上清を、組換えバキュロウイルスを含有する - これはすぐに作業ストックを生成するために使用される、または数年間、4℃で保存することができる。 </li><li>タンパク質の発現を確認するために、PBS500μlにペレットを再懸濁を収集します。 （還元剤を含む）、SDS-PAGEローディング緩衝液50μlの懸濁液50μlを混合する。ランSDS-PAGEおよび遺伝子発現を確認し、抗ヒスチジン抗体を用いたウェスタンブロット分析を行う。モックからの細胞を含む陰性対照としてトランスフェクション（ 図3）。 </li></ol></li><li>ワーキングストックの調製<ol><li> 20分は彼らが皿にアタッチできるよう放置プレートT175センチ2フラスコ中の5×10 5個のSf9細胞/ cm 2としましょう。 TNM-FH培地を、3％FBS（及び1％ペニシリン - ストレプトマイシン、0.1％プルロニックF68）を含有する完全なTNM-FH培地を交換してください。 </li><li>救助上清100μlで細胞を感染させる。 （ステップ1.2.5で説明したように。）6日間、CO 2なしで28℃のインキュベーターで培養すると、細胞が感染した場合、時々チェックしてください。 </li><li>室温で5分間2,000×gでスピンし、上清を集める。これは今のP2の在庫です。このストックは4℃で無期限に保存することができます細胞に感染させるために、P2の株式100μLを使用して、感染の手順を繰り返します。得られた株は、P3又は4℃で保存またはタンパク質発現のために直接使用することができる作業ストック、と呼ばれる。 P3の株価は通常、10が含まれています&lt;SUP&gt; 7 -10 9プラーク単位/ mlを形成する。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2。タンパク質発現および精製 説明文：Sf9細胞は非常によく、バキュロウイルスの成長をサポートしています。しかしながら、大量の組換えタンパク質を分泌するそれらの能力には限界がある。そこで我々は、分泌された組換えタンパク質の発現のための他の昆虫細胞株、ハイファイブ細胞を使用する。これらの細胞は、非常に高い力価13にバキュロウイルスの複製をサポートしていますが、高い分泌能力を持っていません。 <ol><li>ハイファイブ細胞を育っ T175のcm 2のフラスコ中でSFX昆虫細胞培養培地中でハイファイブ細胞を成長させる。継代日おきに1時03分。 200ミリリットルの発現培養のためには、5集密フラスコを成長させる必要があるでしょう。 </li><li>ハイファイブ細胞を回収し、感染<ol><li>あなたの手でフラスコをタップして5のT175センチ2フラスコからハイファイブ細胞を剥離。細胞s​​uspeを収集nsionとを50ml遠心チューブに移す。 </li><li>室温で7分間1200×gでスピン。デカントにより上清を除去し、P3の株式の15ミリリットルでそれらを再懸濁することにより、ペレットを団結させる。 </li><li> （ 図5）流フード内で15分間放置します。 </li><li>清潔な滅菌千ミリリットルシェーカーフラスコにハイクローンSFX培地の200ミリリットルを転送する（オートクレーブ前にアルミホイルで密閉しbufflesことなく、前に細菌培養のために使用されているべきではありません）。 </li><li>シェーカーフラスコにP3/cellサスペンションを転送します。シェーカーに無菌アルミ箔と転送フラスコを密封する。 72〜96時間、28℃、70 rpmで振とうする。 </li></ol></li><li>ハイファイブ細胞発現上清から組換えタンパク質を回収する<ol><li> 500ミリリットルの遠心バケットに72〜96時間感染後の転写培養上清。 4℃で20分間5500×gでスピンその間、シェーカーフラスコを蒸留水で3回すすぎ（のddH 2 O）。 </li><li> PBSを45ミリリットルと50ミリリットルチューブに移す3ミリリットルのNi-樹脂スラリー（200ミリリットル文化ごとに必要な1）。よく振って10分間室温で3000×gでスピン。 PBSをデカントし、ペレットを保持します。ニッケル樹脂ペレットで昆虫細胞上清を混合し、既にすすい振盪フラスコに移す。 （ 図6）を振とうしながら、2〜4時間、4℃でインキュベートする。 </li><li>支持スタンド上のクランプのマウント10ミリリットルのポリプロピレンカラム。両方のキャップを取り外し、（廃棄物）を通る流れを収集するために、列の下にビーカーを置く。シェーカーからシェーカーフラスコを取り、カラムに上清/スラリー混合物を転送するために開始し、それをNi-樹脂を保持し、上清のみが流れます。コラム（ 図7）を介して、ボリューム全体を渡します。 </li><li>洗浄緩衝液（50mMのNa 2 HCO 3、300mMのNaCl、20mMのイミダゾール、pH 8）15mlで樹脂4回洗浄する。すべての洗浄緩衝液ドレンせ列からのキャップ（下側）とそれを閉じます。 </li><li>溶出バッファーの2ミリリットル（50のNa 2 HCO 3、300mMのNaCl、300 mMイミダゾール、pHが8）を追加し、5分間放置します。列を開き、溶出液を収集します。 （溶出バッファーの8ミリリットルの合計）は、この3回繰り返します。 （ 図7）とうしたとき、通常、タンパク質を高濃度で含まれている溶出液は、泡を示しています。可能な限り、濡れた氷の上に溶出液を保管してください。 </li></ol></li><li>バッファー交換及び濃度<ol><li> 20分間4℃で3000×gでのPBS（pH値7.4〜7.6）とPrespin 15ミリリットル限外ろ過、遠心分離装置（HA / NA用30kDaのカットオフが、精製されたタンパク質のサイズによって異なる場合があります）。フロースルー、スピンカラムに溶出液を読み込む捨てる。無菌の氷冷PBSの5ミリリットルでいっぱいにし、4℃で3000×gで60分間スピン</li><li>再び、15の氷冷PBSの添加し、4℃で3000×gで60分間スピンして補充を介して吐出流量このproceを繰り返し1より多くの時間をdure。 </li><li>遠心機からスピンカラムを取得し、バッファ交換した濃縮（通常200μl）を収集します。これは、高度に濃縮された組換えタンパク質である。無菌の氷冷PBS400μlのスピンカラムをすすぎ、濃縮​​液にこれを追加。常に氷上に集中しておいてください。 </li></ol></li></ol> 3。特性評価および品質管理<ol><li>タンパク質濃度を測定すること 濃縮物のアリコートを取り、お好みのタンパク質定量法を用いて、それを測定する。 PBSを添加することにより、1 mg / mlのにタンパク質濃度を設定し、-80℃に小分けし凍結凍結融解サイクルは、タンパク質の構造に悪影響を与えると集約につながることができます。 </li><li> SDS-PAGE及びクマシー染色 SDS-PAGEで目的タンパク質の500 ngのを実行し、クマシー染色を行う。迅速で便利な染色のためのマイクロ波のプロトコルと組み合わせて、クマシー試薬を使用しています。 HAタンパク質は、一般的に64に表示されますNA蛋白質のに対しkDaの約56 kDaの（ 図8AおよびB）のサイズで実行する必要があります。記載されているプロトコルを使用すると、任意の分解産物は表示されません。劣化が発生した場合は、通常の式の間に酵母/真菌汚染のサインです。この場合の手順を繰り返して、無菌のすべてを維持することを確認してください。 </li><li>ウェスタンブロット/ ELISA タンパク質の同一性を検証するために、我々は、特異的抗体を用いたウェスタンブロットまたはELISAアッセイを行うことをお勧めします。理想的には、ELISAアッセイは、立体配座エピトープに結合する抗体（ 例えば抗HA茎抗体1）を用いて行っている。そのような抗体を用いてタンパク質の正しいフォールディング（ 図8C）を確認することができる。 </li><li>活動NA測定 ウイルスのNAの正確​​なフォールディングはまた、NA活性を測定することによって決定することができる。我々は（単なるユーザガイドラインに従ってください）​​市販のNA * STARのアッセイを使用してこのテストを実行することをお勧めします。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

バキュロウイルス発現系を用いた昆虫細胞におけるインフルエンザウイルスHAおよびNAタンパク質の発現は、一般的に単純であるが、いくつかの考慮すべき重要な点がある。導入部で指摘したようにこれは、HAとNAの細胞外ドメインは、それぞれ、三量体化又は四量体化ドメインとの融合で発現されることが、重要である。これらのドメインは、通常、細胞外ドメインが発現されている場合存?...

中国における新規H7N9インフルエンザウイルス株の最近の出現に対する最初の応答として、赤血球凝集素（HA）およびノイラミニダーゼ（NA）は、最初の2つの分離株の遺伝子についてのゲノム配列を有するプラスミドを買収した。我々はすぐに昆虫細胞における組換えHAおよびNAの生産のためのバキュロウイルス発現ベクターを構築することができたこれらのプラスミドを使用した。この発現系はよく我々の研究室で確立されていると私たちの現在進行中の研究プロジェクト1-8の多くに極めて重要であることが判明した。昆虫細胞は、正しくフォールディングおよび翻訳後のタンパク質複合体を改変することができる。これらの修飾は、多くのウイルス糖タンパク質のために重要であるN-結合型グリコシル化を含む。このように、バキュロウイルス系は、非常にインフルエンザウイルス表面抗原を発現するために確立されていることは驚くべきことではない。実際には、HAおよびNAの結晶構造の多くは、昆虫細胞発現タンパク質9-11を使用して解決されている。の別の利点強力なポリヘドリンプロモーターからのウイルス感染駆動発現の結果 - システムは、（50種類以上のHAタンパク質の経験に基づいて）、HA / Lの細胞培養の最大30ミリグラム、その信頼性の高いタンパク質収量にある。 HAおよびNAタンパク質の膜貫通及びエンドドメインの除去は、タンパク質の分泌、可溶性バージョンの発現を可能にし、大幅精製プロセスを容易にする。さらに、これらの外部ドメインは、ヘキサヒスチジンは、タグ付けされ、したがって、 の Ni 2 + -樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。 HAおよびNAタンパク質の膜貫通ドメインは、それぞれ、ホモ三量体およびホモ四量体の形成に寄与する。これらのオリゴマー化を維持するために、我々はNAにHA-およびN-末端四量体化ドメインへのC末端三量体化ドメインを追加する（ 図1）を構築する。私たちは、このような三量体化ドメインは、機能、conseを安定化することを決定的に示しているHAの1の茎ドメインに立体配座エピトープをrved。 NAの正しい四も折り畳みおよびNA機能10を修正するために貢献するかもしれない。三量化や四のドメインを保有する配列と、バキュロトランスファーベクターは、著者からまたはフィールド、9,10,12における他の研究室から要求することができます。 昆虫細胞における分泌タンパク質の発現のためのもう一つの重要な問題は、右の細胞株の選択である。 スポドプテラ·フルギペルダに由来しながら、Sf9細胞は非常によくバキュロウイルス複製を支持し、一般に、ウイルスレスキューおよび増殖のために使用され、それらは、大量のタンパク質を分泌する能力が限られている。 イラクサギンウワバが （一般にハイファイブとして知られている）BTI-TN-5B1-4細胞由来高い分泌能力を有し、このプロトコル13,14における発現のために選択される細胞株である。さらには、ウシ胎児血清を減らしたり、除去しておくと便利です（FB発現培養からのS）。そこで我々は、ウイルスワーキングストックを増殖させるために減少（10％）のFBS含有量のメディアを使用し、我々は、無血清培地におけるタンパク質発現を行う。 組換えHAおよびNAタンパク質は、多くの免疫学的技術のために使用される。おそらく、最も一般的なものは、ヒトまたは動物にワクチン接種時4,6,7,15血清変換を測定するためのELISAアッセイである。有したNAは、抗体分泌細胞を16刺激分子および検出試薬の両方としてELISPOTアッセイにおいて使用される。ベイト分子としてのそれらの使用は、具体的には、次いで（治療的）モノクローナル抗体（mAb）を単離するために使用することができる形質芽又はB-細胞の他のタイプのソートすることを可能にする。組換えHAおよびNA分子はさらに、これらのmAb 8の特徴付けに使用される。他の例では、pH安定性又は受容体特異性が異なるウイルス分離株によって発現有する研究、または定量的に特異的なNAの酵素を評価することが含まれる阻害剤に対する活動や抵抗。さらに、組換え、精製されたHAは、不活性化インフルエンザウイルスワクチンのHA含量を標準化するために使用することができる。 重要なのは、rHAの（そしてある程度NA）ワクチン候補は、現在、1ワクチン候補が2013 2,17-19にFDAによって認可されていると、動物モデルおよびヒト臨床試験で検証されています。これらの新規なワクチンの利点は、これらのタンパク質の組換え性質のために、高い成長再集合ウイルスの発生の労働集約的なプロセスを回避することができる、ということである。おそらく、より関連性の高い彼らのHA収率が高く、歪みの歪みに再現可能であるという事実である。これらのワクチンは、卵を含まない系で生産されるためにも、彼らは卵アレルギーを持つ人々のための問題となるタンパク質の汚染物質を含んでいない。 ここでは、新たな中国のH7N9インフルエンザウイルスは、A /アインの2分離株からのHAおよびNA蛋白質を発現することにしましたui/1/13とA/Shanghai/1/13 20,21。これらは、タイムリーな例であるが、記載されたプロトコルは、任意のインフルエンザA及びB HA又はNAタンパク質の発現のために使用することができ、任意の他の分泌されたウイルスまたは細胞性蛋白質を発現するように適合させることができる。三量体または四量体の膜貫通タンパク質は、それぞれ、HA及びNAために使用される発現カセットにクローニングすることができる。しかし、ほとんど可溶性分泌細胞タンパク質は、例えば、インターフェロンのように、安定化のための追加のドメインを必要としないし、C末端ヘキサヒスチジンタグと共にのみ表現することができる。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Baculovirus expression system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNM-FH insect medium</td>
			<td>Gemini Bioproducts</td>
			<td>600-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone SFX-Insect</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P/N58760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F68</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1000702664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC902024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Columns (5 ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Max efficiency DH10Bac bacteria</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10361-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K210015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2399-100G</td>
			<td>for elution and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Five cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B85502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of functional recombinant hemagglutinin and neuraminidase proteins from the novel h7n9 influenza virus using the baculovirus expression system

バキュロウイルス発現系は、組換えタンパク質の発現のための強力なツールです。ヘマグルチニン（HA）およびノイラミニダーゼ（NA） - ここでは、インフルエンザの正しく折り畳まれ、グリコシル化されたバージョンのウイルス表面糖タンパク質を産生するために使用すること。一例として、我々は最近、中国に出現した新規H7N9ウイルスにより発現HAおよびNA蛋白質を選びました。しかし、プロトコルが容易に任意の他のインフルエンザA及びBウイルス株によって発現されるHA及びNAタンパク質に適合させることができる。組換えHA（rHAの）とNA（RNA）タンパク質は、ELISPOTおよびELISAなどの免疫学的アッセイのための重要な試薬であり、ワクチンの標準化、抗体の検出、単離および特性のために広く使用されてもいる。さらに、組換えNA分子は、小分子阻害剤のスクリーニングに使用し、NAの酵素機能の特徴付け、ならびに抗ウイルス剤に対する感受性のために有用であることができる。組換えHAタンパク質はまた、バイあるNGは、動物モデルにおける実験ワクチンとしてテストされ、組換えHAに基づくワクチンは、最近、ヒトにおける使用のためのFDAによって認可されました。それは、迅速かつ低コストで大量のタンパク質の産生を可能にするため、我々はこれらの分子を産生するためにここで説明する方法は、単純であり、インフルエンザ実験室での研究を容易にすることができる。ここで我々は、インフルエンザウイルス表面糖タンパク質に焦点を当てているが、この方法はまた、他のウイルスおよび細胞表面タンパク質を産生するために使用することができる。

A/Shanghai/1/13とA/Anhui/1/13からのHA分子は、約20 mg / Lの文化の収量とよく表現。両株のNA分子はA/Shanghai/1/13 0.2 mg / Lの培養物からA/Anhui/1/13 0.7ミリグラム/ Lの範囲の中程度の発現レベルを示した。 4つ全てのタンパク質調製物は、発現レベルによって説明することができるのNAよりも高い純度であると有する（ 図8AおよびB）なしにはほとんど不純物を有していた。 A/Shanghai/1/...

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Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

ここでは、昆虫細胞中での新規な中国のH7N9ウイルス由来の正しく折り畳まれ、機能性インフルエンザウイルス表面抗原を発現する方法を記載している。技術は、任意のウイルスまたは細胞表面タンパク質の外部ドメインを発現するように適合させることができる。

バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K ビュー.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. ここでは、昆虫細胞中での新規な中国のH7N9ウイルス由来の正しく折り畳まれ、機能性インフルエンザウイルス表面抗原を発現する方法を記載している。技術は、任意のウイルスまたは細胞表面タンパク質の外部ドメインを発現するように適合させることができる。 

ビデオ: Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

免疫・感染学

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

豚からのインフルエンザAウイルスの検出および単離のための鼻ワイプ

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...