この作品は、国立衛生研究所5T32AI7493-20と5R01AI089337-03を付与することによって部分的にサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備で何の役割も持っていません。

承認されたプロトコル番号101109272の下で本明細書に記載されるようバーミンガム動物実験を使用してケア委員会でのアラバマ大学は、マウスの使用を承認しました。 1.遺伝的構築改変プラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6抗原キャプシド取り込み戦略と<ol><li>シャトルプラスミドの構築HVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5S <ol><li> hexon5遺伝子ののAccIに制限酵素サイトのAgeIとの間に合成されたDNA配列HVR1-KWASを含むプラスミドを注文。 </li><li> 37℃で3時間のための酵素のAgeI（6台）とのAccI（6台）で合成フラグメント（HVR1-KWAS）の6μgのダイジェスト。電気泳動による2％のアガロースゲル中で消化された断片を解決し、製造業者のプロトコールに従ってDNAゲル抽出キットを用いて断片を精製します。 </li><li> T4 DNAリガーゼおよびリガーゼBを使用し、1：インサートのモル比に基づいて、3でベクトルにufferはをAgeIとのAccIの部位を介して、2時間室温で10μlの体積で以前に構築シャトルプラスミドHVR5-彼6 / pH5S 17の100 ngのに断片（HVR1-KWAS）の12 ngのを連結します。 </li><li> （1800 Vで）エレクトロでエレクトロDH5α細胞を50μlにライゲーション産物を10μlのうち1μLを変換します。形質転換されたDH5α細胞にSOC培地950μlを添加して、300回転数で、37℃で1時間混合物をインキュベートします。カナマイシンを含むルリア - ベルターニ（LB）寒天上で1ミリリットルの混合物の100〜200μLを広げ、37℃でO / Nインキュベート。 <ol><li> 〜断片HVR1-KWASをターゲットにPCRによって10個のコロニーをスクリーニングするために、フォワードプライマー（TATGTGTGTCATGTATGCGT）を混ぜて（製造業者のプロトコルに従って）PCRマスターミックス溶液にプライマー（GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC）とシングルDH5αコロニーを逆転。 PCRマスターミックス溶液のマニュアルを参照して、サーモサイクラー上のサンプルを実行します。。 </li><li>セクション1.1.4.1でスクリーニングクローンでフラグメントHVR1-KWASを配列決定するために、フォワードプライマー（TATGTGTGTCATGTATGCGT）を使用します。 </li></ol></li></ol></li><li>プラスミドPAD5 /の建設H5-HVR1-KWAS-HVR5、彼の6 <ol><li>ダイジェスト6μgのHVR1-KWAS-HVR5-彼の6/37°Cで3時間のための酵素のEcoRI（6台）とのPmeI（6台）でpH5S、および相同組換えアームとデュアル修正さhexon5遺伝子を含む断片を精製し、としてステップ1.1.2で述べました。 SwaIで骨格プラスミドPAD5 /ΔH5（GL）16を線形化します。 </li><li>シャトルプラスミドと（1800 Vで）エレクトロにおける相同組換えのためのエレクトロBJ5183細胞を50μlに直線化PAD5 /ΔH5（GL）バックボーンの100 ngのからターゲット断片100ngのを同時形質転換。形質転換細胞にSOC培地950μlを添加して、37℃、300rpmで1時間混合物をインキュベートします。 1ミリリットルの混合物200μlの - 100を広げま​​す37℃でO / Nインキュベーションのためにカナマイシン（最終50μg/ ml）を含むLB寒天上。 <ol><li> 3ミリリットルシェーカー（250rpmで、37℃）でO / Nインキュベーションのために、カナマイシン（最終50μg/ ml）を含む液体LBに〜10の小さなコロニーを選択してください。培養物からプラスミドを抽出します。ステップ1.1.4.1に示すように、断片HVR1-KWASを標的とすることによって、10個のコロニーをスクリーニングするためにPCR分析を使用してください。 </li><li>バックボーンゲノムのpIXの断片を標的とするPCR分析によって、同じコロニーをスクリーニングするために、フォワードプライマー（AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT）を混合し、（製造業者のプロトコルに従って）PCRマスターミックス溶液にプライマー（CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT）とシングルBJ5183コロニーを逆転。 PCRマスターミックス溶液のマニュアルを参照することにより、サーマルサイクラーにサンプルを実行します。 </li><li> PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-Hisを6としてPCR二重陽性コロニーを指定します。 </li></ol></li><li>プラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6の100 ngのトランスフォームDH5α細胞に、ステップ1.1.4に示します。 <ol><li>ステップ1.1.4.1に示すように、断片HVR1-KWASを標的とすることによって〜10個のコロニーをスクリーニングするためにPCR分析を使用してください。 </li><li>ステップ1.2.2.2に示すように、主鎖ゲノムのpIXの断片を標的とすることによって、同じコロニーをスクリーニングするためにPCR分析を使用してください。 </li><li> PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6にフラグメントHVR1-KWASを配列決定するために、フォワードプライマー（TATGTGTGTCATGTATGCGT）を使用します。 </li></ol></li></ol></li></ol>変更されたAd5ウイルスベクターのAd5 /の調製H5-HVR1-KWAS-HVR5、彼の6 <ol><li>高グルコースDMEM中にFBS（最終10％）、100×非必須アミノ酸（最終0.1ミリモル）、200mMのL-グルタミン（最終2ミリモル）及びペニシリン/ストレプトマイシン溶液（最終1％）を添加して完全培地を構成します。 （85％の加湿条件下で、37℃、5％CO2）培養インキュベーター中で完全培地でヒト胚腎臓（HEK293）細胞を維持します。 </li><li>ウイルスのレスキューVEのCTORのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5、彼の6 <ol><li> 80％のコンフルエンスで単層を達成するための完全培地および培養O / Nを5 mlを含むつのT-25フラスコ中のHEK293細胞のシード3.0×10 6。 </li><li> 3時間37℃で制限酵素PacIで100μlの体積（15単位）でPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6の15μgのを線形化。 <ol><li>線形化PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5を-彼の抽出6等量のフェノールで二回（1分間万XG）反応を遠心分離することによって：クロロホルム：イソアミルアルコール（25時比：24：1）ヒュームフード中、及び混合溶液（100％エタノールを300μlと酢酸ナトリウムの10μl）を、70％エタノール700μlの逐次遠心分離（10分間10,000×gで）によって。各遠心分離工程において、上清を捨てます。 </li></ol></li><li>蒸留水〜40μlあるいはトリスEDTA（TE）緩衝液中の精製プラスミドを再懸濁します。光学ドを測定することにより、プラスミドDNAを定量260 nmでnsity（OD）。 </li><li>製造元のマニュアルに従って、T-25フラスコ内の商業リポソームトランスフェクション試薬との線状化プラスミド3μgのをトランスフェクト。 6時間培養インキュベーター中でトランスフェクション後、その後のインキュベーションで完全培地でのトランスフェクション培地を変更します。個々のウイルスプラークが形成されるまで、2〜3日ごとに完全培地を交換することによりトランスフェクトされた細胞を維持します。 </li><li>プラークは、完全細胞変性効果（CPE）を開発する場合、4℃で10分間、300×gで培地を遠心分離することにより無菌フード、収穫細胞溶解物にフラスコから残りの細胞をこすり取ります。 2％のFBSを含む培地〜1ml中の細胞ペレットを中断し、凍結融解を4回によって、細胞を破壊。 4℃で10分間10,000×gで溶解物を遠心分離した後にレスキューされたウイルスを含む上清を収集します。 </li></ol></li><li>ウイルスベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6の大規模な伝播<ol><li>目を伝播T-25フラスコから完全溶解液に1/3に感染させることにより、無菌フード内のHEK293細胞を含むT-75フラスコ内の電子ウイルス。完全なCPEが培養インキュベーターで2〜3日以内に発症することができます。ステップ2.2.5で述べたように溶解物の上清を収穫。 </li><li>ウイルス増殖の条件に応じて、T-75フラスコから完全な溶解物を1/2に感染させることにより、無菌フード内の二時五十九T-175フラスコ中でウイルスを増殖。完全なCPEが培養インキュベーターで2〜3日以内に発症することができます。ステップ2.2.5で述べたように溶解物の上清を収穫。 </li><li>以前のT-175フラスコ（複数可）からの完全溶解液に1/2に感染させることにより、無菌フード内の1ダース以上のT-175フラスコ中でウイルスを増殖。ウイルス増殖条件と必要としているウイルスの量に基づいて、フラスコの使用量を決定します。完全なCPEが培養インキュベーター中で2〜3日以内に発生した場合、ステップ2.2.5で述べたように溶解物の上清を収穫。 </li></ol></li><li> Purif塩化セシウムによるのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6のication <ol><li>塩化セシウムとの接触を回避しながら、1.33グラム/ mlおよび1.45グラム/ mlの5 mMのHEPES中のCsCl溶液の2密度を準備します。 </li><li>負荷滅菌超遠心管中で塩化セシウム（1.33グラム/ ml）の4mlを、ゆっくり管の底部に対して塩化セシウム（1.45グラム/ミリリットル）の4ミリリットルをロードします。無菌フード内のグラデーションの上にゆっくりと溶解液上清の負荷4ミリリットル。 </li><li>欠陥/高いウイルス帯から成熟/下ウイルスバンドを分離するために4℃で3時間110,000×gでチューブを遠心。 33 G針で武装3ミリリットル注射器を使用して、下のバンドを収集し、無菌フード内の4ミリリットルボリュームに5 mMのHEPESでバンドを希釈。 </li><li>ステップ2.4​​.2で説明したように、2つのCsCl溶液の密度およびウイルスの希釈バンドと別のチューブをロードします。 4℃で11万XGのO / Nでチューブを遠心します。ステップ2.4​​.3で説明したように、ウイルスバンドを収集します。 </li><li> dialysで収集したウイルス液を注入し無菌フード内で33 G針で武装3ミリリットル注射器によりカセットです。 </li><li> 1×透析緩衝液700mlの中にカセットを置きます（1 Lレシピ：10×100mlのPBS、100％グリセロールを100mlの蒸留水800ミリリットル、0.22μmのフィルターを通してバッファをフィルタリングする）と、透析緩衝液を交換するごとに3 4回時間。針付き注射器を用いて透析ウイルス液を吸引除去します。 </li></ol></li></ol>レスキューウイルスベクターの3検証<ol><li>ウイルスベクター滴定<ol><li>小さなチューブにおけるウイルス溶解緩衝液（トリスEDTAで10％SDS）で20、および56℃で、すべてのチューブをインキュベート：10〜1：ウイルスの物理的力価は、1でウイルスと透析緩衝液（バックグラウンドコントロール）の両方を希釈10分。 </li><li>バイオフォトメーターの電源をオンにし、OD 260 nmでの吸光度のモードを設定します。 「ブランク」下部をクリックすることにより、バックグラウンド信号のバランスをとるために：希釈透析バッファー（10 1）を使用します。バイオフォトメーターSCRの「10 + 90」と入力しEEN、および希釈したウイルス（1：10）の信号を読み出します。 </li><li>ステップ3.1.2での方法に従うことにより、代わりにバイオフォトメーター画面に「5 + 95」を入力します。希釈したウイルス（20 1）の信号を読みます。 1.1×10 12で2ウイルス読み出し数を乗算し、2の希釈から2個々の力価に基づいて、VP / mlのような単位での平均力価を計算します。 </li><li>ウイルス感染力価（IP / ml）のために、10日後の感染にHEK293細胞に感染の深さを決定するために統計的なカーバーTCID 50法14を使用して（解像度） </li></ol></li><li>ウイルスベクターの抗原暴露表示の評価<ol><li>コートELISAプレートにおけるウイルスベクターとは、標準的なELISA法14の残りの手順に進みます。取り込まれた抗原14を対応の検出のためのヒト抗gp41の ​​（2F5）モノクローナル抗体（mAb）およびマウス抗Hisタグモノクローナル抗体を使用してください。 </li><li> denatuにウイルスベクターを解決赤のタンパク質ゲル電気泳動（SDS-PAGE）および標準ウエスタンブロット法14の残りの手順に進みます。取り込まれた抗原14を対応の検出のためのヒト抗gp41の ​​（2F5）モノクローナル抗体（mAb）およびマウス抗Hisタグモノクローナル抗体を使用してください。 </li></ol></li><li>のAd5-positve血清をバイパスする能力にベクターのin vitro評価 <ol><li> （85％の加湿条件下で、37℃、5％CO 2）培養インキュベーター中、完全培地中でHeLa細胞を維持します。最小必須培地イーグル（MEME）にFBS（最終10％）を添加して完全培地を構成し、200mMのL-グルタミン（最終2mMの）およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液（最終1％）。 </li><li> 2時間、1×10 6細胞/ウェルでシード、6ウェルプレート中のHeLa細胞を、そして（85％加湿条件下で、37℃、5％CO 2）培養インキュベーター中でプレートをインキュベートします。 （ウイルスベクターの5 IP /セルとのAd5陽性血清（0.1μlあるいは0μl）をインキュベート細胞を含む6ウェルプレート上に混合物を添加する前に1時間培養インキュベーター中でのAd5またはのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6）。 </li><li> 24時間での感染（HPI）を投稿し、溶解緩衝液0.5mlのPBSと溶解細胞で細胞を​​1回すすいでください。 5分間、15,000×gで遠心分離し、上清を収集します。ウイルスは、ルシフェラーゼ遺伝子が含まれているため、ルシフェラーゼ信号読み出しのためのルシフェラーゼ基質100μlを20μlの上清を混ぜます。 </li></ol></li></ol>レスキューウイルスベクターの4免疫学的評価<ol><li> Ad5のとのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6：2の免疫グループを準備します。 <ol><li> 2週間の間隔で、相同「プライム-ブースト」の免疫レジメンにおいて、1×10 10 VP /マウスでウイルスを筋肉内マウス（n = 8 /群）を注入します。 </li><li>すべての注射後2週間目に、動物にランセット（5ミリメートルのチップ長）で出血頬によって麻酔なしでマウスを出血1.5ミリリットルチューブに血液を採取。 </li></ol></li><li>上下反転してによってチューブに血液を混和し、室温で30分間血液をインキュベートします。新しい1.5 mlチューブに4℃、転送血清（上層）で5分間万×gでチューブをスピン。 <ol><li> 5 4℃で分と新たに-80℃で貯蔵1.5 mlチューブをマークする転送血清10,000×gで新しいチューブをスピン。 </li></ol></li><li>血清ベースのELISAによって抗原特異的体液性免疫の評価<ol><li>彼のペプチド（1mmにストック）およびHIV-1ペプチド（1mmにストック）別途100で希釈します。 </li><li> mMの炭酸塩緩衝液（pH 9.5）、10μMのペプチドでコーティング濃度を達成します。ウェルあたり100μLを添加し、4℃でプレートO / Nをインキュベートすることによって、別々に希釈したペプチドでコーティングしたELISAプレートを。 </li><li> 200μL/ウェルで1時間ブロックPBST中の5％BSAで4回PBSTでプレートを洗浄します。ブロッキングbufに1：100希釈でプレートにマウス血清を適用しますFER、100μl/ウェル。室温で2時間インキュベーションインキュベートします。 </li><li> 4回PBSTでプレートを洗浄します。 100μl/ウェルでブロッキング緩衝液中で室温で30分間インキュベートすることによりプレートをブロックします。 </li><li> 100μL/ウェルで個々に彼のペプチドおよびHIV-1ペプチドでコーティングされたプレートの両方に：ヤギ抗マウスIgG-HRP（ブロッキング緩衝液中1：5000）を適用します。室温で2時間インキュベートします。 PBSTでプレートを洗浄します。 </li><li> 30分間HRP基質とインキュベートした後、OD450 nmでプレートを読みました。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Cheng, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+the+simian+immunodeficiency+virus+Env+and+Rev+proteins+by+a+recombinant+human+adenovirus+host+range+mutant.">Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant.</a> Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+antigen+incorporation+within+adenovirus+hexon+hypervariable+2+for+a+novel+HIV+vaccine+approach.">HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach.</a> PloS one. 5, e11815 (2010).</li><li>DeMatteo, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+adenovirus+transgene+expression+in+mice+through+neonatal+intrathymic+tolerance+induction+without+the+use+of+immunosuppression.">Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression.</a> Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+adenovirus-based+vector+elicits+a+specific+humoral+immune+response+against+the+V3+loop+of+HIV-1+gp120+in+mice+through+the+'Antigen+Capsid-Incorporation'+strategy.">A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy.</a> Virology journal. 11, 112 (2014).</li><li>Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Vaccine+Development.">Viral Vectors for Vaccine Development.</a> INTECH. , (2013).</li><li>Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+as+a+carrier+for+the+development+of+influenza+virus-free+avian+influenza+vaccines.">Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines.</a> Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).</li><li>Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intrinsically+disordered+region+of+the+adenovirus+capsid+is+implicated+in+neutralization+by+human+alpha+defensin+5.">An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5.</a> PloS one. 8, e61571 (2013).</li><li>Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5+neutralizing+antibodies+target+both+hexon+and+fiber+following+vaccination+and+natural+infection.">Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection.</a> Journal of virology. 86, 625-629 (2012).</li><li>Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+innate+and+pre-existing+immunity+on+adenovirus+therapy.">The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy.</a> Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+and+CD8++T+lymphocytes+both+contribute+to+immunity+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors.">Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors.</a> Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).</li><li>Sumida, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+adenovirus+serotype+5+vaccine+vectors+are+directed+primarily+against+the+adenovirus+hexon+protein.">Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein.</a> Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).</li><li>Bradley, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+serotype+5-specific+neutralizing+antibodies+target+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).</li><li>Gahery-Segard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+recombinant+capsid+proteins+of+adenovirus+in+humans:+antifiber+and+anti-penton+base+antibodies+have+a+synergistic+effect+on+neutralizing+activity.">Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity.</a> Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).</li><li>Gu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+multivalent+adenoviral+vectors+for+HIV+vaccination.">Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination.</a> PloS one. 8, e60347 (2013).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+enterovirus+71+with+neutralizing+epitope+incorporation+within+adenovirus+type+3+hexon.">Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon.</a> PloS one. 7, e41381 (2012).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+adenovirus+serotype+5+packaged+by+serotype+3+hexon.">Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon.</a> Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sites+in+adenovirus+hexon+for+foreign+peptide+incorporation.">Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation.</a> Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-specific+neutralizing+antibody+epitopes+of+human+adenovirus+type+3+(HAdV-3)+and+HAdV-7+reside+in+multiple+hexon+hypervariable+regions.">Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions.</a> Journal of. 86, 7964-7975 (2012).</li><li>Parker, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+definition+of+the+epitope+on+the+gp41+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+for+the+neutralizing+monoclonal+antibody+2F5.">Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5.</a> Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).</li><li>Farrow, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+Hexon+Modified+Adenoviral+Vectors+Integrated+with+gp83+Epitope+Provides+Protection+against+Trypanosoma+cruzi+Infection.">Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection.</a> PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).</li><li>Krause, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopes+expressed+in+different+adenovirus+capsid+proteins+induce+different+levels+of+epitope-specific+immunity.">Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity.</a> Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).</li><li>Omori, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+a+fiber+protein+in+an+adenovirus+vector+improves+in+vitro+gene+transfer+efficiency+to+the+mouse+microglial+cell+line.">Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line.</a> Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).</li><li>Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+adenovirus+vectors+containing+heterologous+peptide+sequences+in+the+C+terminus+of+capsid+protein+IX.">Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX.</a> Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).</li><li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+human+adenovirus+type+3+vector+containing+two+foreign+neutralizing+epitopes+in+hexon.">Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon.</a> Virus research. 183, 67-74 (2014).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+human+adenovirus+serotype+3+packaged+by+serotype+7+hexon.">Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon.</a> Virus research. 160, 214-220 (2011).</li><li>Kim, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adenovirus+vector+incorporating+carbohydrate+binding+domains+utilizes+glycans+for+gene+transfer.">An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer.</a> PloS one. 8, e55533 (2013).</li><li>Vasconcelos, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen-induced+proapoptotic+phenotype+and+high+CD95+(Fas)+expression+accompany+a+suboptimal+CD8++T-cell+response:+reversal+by+adenoviral+vaccine.">Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine.</a> PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).</li><li>Matthews, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+herpes+simplex+virus+type+1+thymidine+kinase+and+firefly+luciferase+fusion+into+the+adenovirus+protein+IX+for+functional+display+on+the+virion.">Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion.</a> Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ワクチンの開発のためのAd5変更の伝統的な導入遺伝子戦略の適用は主に、Ad5のPEI 4,6に関連するボトルネックに減少されました。この戦略は、抗原の関心とのAd5の中和エピトープを交換したAd5のNABによる中和を回避し、強固な免疫の発生を促進することができるので、このボトルネックは、部分的に、代替的な抗原キャプシド組み込み戦略（ 図1A）を適用することによっ?...

ヒトアデノウイルス（AD）は、二本鎖DNAゲノムを含む正二十面体ヌクレオカプシドと中型、非エンベロープウイルスです。広告は、7つのグループに分類（Gを介してA）と、アデノウイルスファミリーに属します。各グループは、異なる血清型のウイルスが含まれています。これは、グループCは最も広範に研究され、最も広く、遺伝子治療や予防接種などのベクトル化手法に適用されてきたから、アデノウイルス血清型5（Ad5の）の。 伝統的な導入遺伝子の戦略が開発され、目的遺伝子を有するウイルス初期遺伝子の変位することを特徴とするAd5の修正のために適用され、目的遺伝子の宿主中での集表現されています。例としては、サル免疫不全ウイルス1のrev遺伝子と初期遺伝子3（E3）を置き換えることによってpENV9 /Ad5hrΔE3の構築であり、ヒト免疫不全のgag遺伝子と初期遺伝子1（E1）を置き換えることによりAdCMVGagの建設ウイルス（HIV）2、およびlac Z遺伝子の 3でE1を置き換えることによって広告のlac Zの構築。 Ad5の上の伝統的な導入遺伝子戦略の広範なアプリケーションは、次のメリットに依存しますのAd5、ウイルスおよびウイルス増殖の実現可能な遺伝子工学、外来遺伝子挿入物の大規模な宿泊施設とのAd5 4,5の安全のためにホストの広い範囲。しかし、この戦略を使用してAd5のベクトル化臨床治療の有効性を減少させたがAd5のは、子供と大人4,6の大部分の間でとても普及しているので、主に、Ad5のPEIと関連していることがマッピングされている主要なボトルネック、となっています。 Ad5のの主要なボトルネックを克服するために、主な目的は、Ad5のPEIを回避代替戦略を開発することです。このような中和抗体（NABS）8-10およびCD8 + T細胞応答などの自然免疫7、適応免疫は、Ad5のに対して、10が共同することが示されていますAd5のNABSはAd5のPEI 10,11に貢献で支配的な役割を果たしているように見えると、Ad5のPEIにntribute。また、Ad5のは、主要なタンパク質、ヘキソン、ファイバーおよびペントンベースなどのキャプシドタンパク質に位置する標的エ​​ピトープを、NABS。このうち、ヘキソンはAd5のNABS 8,11-13の主要な標的です。これらの知見に基づいて、革新的な抗原キャプシド取り込み戦略が導入されています。この新規戦略はNABSかつ効率的なのAd5ベクター投与により減少した認識をもたらす、タンパク質の関心のAd5中和エピトープをシフトさせるか、マスクのAd5キャプシドタンパク質、上の交換または取り込みを強調しています。それはまた、ホストが強固な体液性免疫と直接免疫系4,14,15に抗原の関心を提示することによって、強力な細胞性免疫を誘発することができますので、この戦略は競争力があることは注目に値します。この戦略に基づき、分子クローニングおよび組換え広告ウイルスベクターのレスキューは、構造的に分割することができます4つの主要なステップには、（a）いずれかのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または合成により目的遺伝子断片を調製します。 （b）は、アデノウイルス骨格に目的遺伝子断片との相同アームを含んでいるシャトルプラスミドへの遺伝子断片の連結を、 （C）線形化バックボーンプラスミドPAD5 /ΔH5（GL）16で目的遺伝子断片を含むシャトルプラスミドを同時形質転換することにより、相同組換え、 （d）の線状化組換えアデノウイルスプラスミドのトランスフェクションは、抗原の関心を組み込んだ組換えAdベクターを救出します。 私たちのグループと他のいくつかは、別の感染性病原体に対する広告ベクターワクチン開発のためのこの代替広告の取り込み戦略を高めています。我々は、組換えAdベクターの生成を報告したAd-HVR1-LGS-彼のAd5ヘキソン（hexon5）のHVR1ロケールにHis標識HIV-1抗原V3を組み込むことにより、6 -V3。この生成されたベクターは、STRをトリガV3エピトープ4に固有オング液性免疫応答。また、hexon5 2のHVR2ロケールにHIV-1膜近位外部ドメイン領域（MPER）を組み込むことによって、Ad5の/ HVR2-MPER-L15ΔE1の開発を報告しました。また、博士周のグループは、Ad血清型3（のAd3）ベクトル化ワクチンを、 すなわち 。開発するために、この広告の取り込み戦略の利点を使用していた、のAd3のHVR1にエンテロウイルス71の中和エピトープSP70を組み込むことにより、ウイルスベクターR1SP70A3の生成ヘキソン（hexon3）。 R1SP70A3はエンテロウイルス71チャレンジ15に対する保護の高い率につながる強いNABSおよびエピトープSP70に特異的IFN-γ産生を、生成されました。 テクニカルリファレンスの目的のために、私たちの研究では、HVR1に、HIV-1抗原を組み込むことによって、二価のAd5ベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6の生成に焦点を当てる定性的な抗原キャプシド取り込み戦略を利用しましたANダhexon5のHVR5にHisタグ。生成されたウイルスベクターはまた、免疫学的に評価しました。抗原キャプシド取り込み戦略は異なる感染症に対するAd5のベクトル化ワクチン接種アプローチの開発に向けて利用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td>for cell spliting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30378.02</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td>for dialysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0301</td>
			<td>for virus lysis buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100X Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200mM/L L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin solution&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>component of culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with high glucose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td>for HEK293 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M5650</td>
			<td>for HeLa cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3803-100ML</td>
			<td>for large size of DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium chloride&#160;</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>C68050</td>
			<td>for virus purificiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td>for CsCl solution preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>51-0036</td>
			<td>for virus rescue and upscale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>for neutralization assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 flask</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430641</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-175 flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910</td>
			<td>for cell culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>NA</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tube</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>344059</td>
			<td>for virus purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>66380</td>
			<td>for virus dialysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human anti-gp41 (2F5) mAb</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>1475</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-His tag mAb</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>A00186</td>
			<td>for immunological assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>46-003-CR</td>
			<td>for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix solution</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>201445</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal lancet (point length at 5mm)</td>
			<td>MEDIpoint</td>
			<td></td>
			<td>for mice bleeding&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>for virus physical titer titration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing the antigen capsid-incorporation strategy for the development of adenovirus serotype 5-vectored vaccine approaches

アデノウイルス血清型5（Ad5の）が広くワクチン開発のための従来の方法を用いて導入遺伝子改変されています。臨床試験においてこれらの伝統的改変Ad5ベクターの減少効力は主として人口の大部分の間でのAd5既存の免疫（PEI）と相関させることができました。 Ad5のPEIの懸念を解決することによってのAd5-ベクターワクチンの開発を促進するために、革新的な抗原キャプシド取り込み戦略が採用されています。この戦略のメリットにより、Ad5のベクトル化は、まず以前に構築シャトルプラスミドHVR5-彼6 / pH5Sに超可変領域（HVR）ヘキソンの1をサブクローニングすることにより、ヘキソンシャトルプラスミドHVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5Sを構築し、これHVR5に組み込む彼の6タグを持っていました。 HIVエピトープELDKWASを含むHVR1このDNA断片を合成しました。 HVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5Sその後、線形化したと、線形化骨格プラスミドPAD5 /ΔH5（GL）で同時形質転換します相同組換えのため。この組み換えプラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5は、彼の6は、ウイルスベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-彼の6を生成するために、細胞にトランスフェクトしました。このベクターは、ウイルスの物理的力価（VP / mlで）によって示される定性的なフィットネス、感染力価（IP / ml）および対応するVP / IP比を有することが確認されました。 HIVエピトープおよびHis 6タグの両方がAd5のキャプシドの表面に露出していた、と彼ら自身のエピトープ特異的抗原性を保持していました。中和アッセイは、 インビトロでのAd5陽性血清による中和を回避するために、この二価のベクターの能力を示しました。マウスの免疫は、HIVエピトープおよびHis 6に特有の強固な体液性免疫の生成を実証しました。この証明の原理研究は、抗原キャプシド取り込み戦略に関連するプロトコルを実行可能に異なるキャプシドタンパク質を修飾することにより、ベクトル化のAd5ワクチンの生成のために利用され得ることを示唆しました。このプロトコルは、さらにfとすることができましたurtherまれな血清型のアデノウイルスベクター化ワクチンの生成のために修正されました。

抗原キャプシド組み込み戦略（ 図1A）は 、二価のAd5ウイルスベクターのAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-Hisの6を生成するために利用されました。まず、シャトルプラスミドHVR1-KWAS-HVR5-彼6 / pH5Sは、以前の構築シャトルプラスミドHVR5-彼6 / pH5S 17にHVR1-KWAS断片をサブクローニングすることにより構築しました。第二に、プラスミドPAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6 <...

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Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

ここでは、実証の原則二価のアデノウイルス5型（Ad5）ベクトルを生成するためのプロトコルを提示するAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6抗原キャプシド取り込み戦略を利用することによって。このベクターは、定性的フィットネス、Ad5の陽性in vitroでの血清、および抗原性ならびに組み込まれた抗原に対する免疫原性を脱出する能力を示すことが実証されました。

アデノウイルス血清型5ベクターワクチンアプローチの開発のための抗原キャプシド取り込み戦略を活用

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

utilizing-antigen-capsid-incorporation-strategy-for-development

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K ビュー.  University of Alabama at Birmingham. ここでは、実証の原則二価のアデノウイルス5型（Ad5）ベクトルを生成するためのプロトコルを提示するAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5 -彼の6抗原キャプシド取り込み戦略を利用することによって。このベクターは、定性的フィットネス、Ad5の陽性in vitroでの血清、および抗原性ならびに組み込まれた抗原に対する免疫原性を脱出する能力を示すことが実?...

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Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

アデノウイルス由来のシステムの助けを借りて効率的な組換えパルボウイルスの生産

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

免疫・感染学

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

ラベルフリーバイオセンサー技術を活用乳癌におけるヒト白血球抗原バイオマーカーの検出

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

Development of an &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; model system for studying the interaction of &lt;em&gt;Equus&lt;/em&gt; &lt;em&gt;caballus&lt;/em&gt; IgE with its high-affinity receptor Fc&amp;#949;RI

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

開発<em&gt; in vitroで</emとの相互作用を研究するための&gt;モデル系<em&gt;エクウス</em&gt;<em&gt; caballus</emその高親和性受容体FcεRIとした&gt;のIgE

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

自己免疫に対する幹細胞由来の抗原特異的制御性T細胞の開発

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

インフルエンザ抗原マイクロアレイを用いたウイルスサブタイプにわたる血清抗体の幅を測定

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...