。サンテ-この作品は、自然科学とカナダの工学研究評議会からの助成金によってサポートされていましたキム・ギルバートは、フォン・ド・ラ・RECHERCHEケベックから学生の身分を保持しています。

動物は動物ケアのカナダの協議会のガイドラインに従って、地元の動物ケア委員会の規制に準拠して処理される。ラットは、（21〜22ºCの温度と40〜50％の湿度）個別に一定の条件下で飼育されています08:00から始まる、12時間明暗サイクルを含みます。チョウペレットと水道水は、研究を通して自由に摂取されています。サプライヤーによる送達後3日間の馴化期間は、実験前に許可されています。 300〜800グラムの体重の雄性Sprague-Dawleyラットは、日常このプロトコルで使用されてきました。 1. MI手術<ol><li>ケタミン60 mgの/ kgおよびキシラジン10mg / kgの腹腔内注射で麻酔を誘導します。足が挟まれているときに反射の欠如によって適切な麻酔を確認してください。 </li><li>手術部位を剃ります。 （16G 1.77インチ）をカテーテルと側臥位で動物を配置します。気管内チューブを挿管ラット。 37℃前後の温度を維持するために加熱パッドの上に動物を配置します。 2％イソフルランする気管内チューブを接続します。 </li><li>グルコン酸クロルヘキシジン、イソプロピルアルコールで手術部位を準備します。手術中、滅菌手袋、滅菌機器を使用しています。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、両眼に眼軟膏を適用します。動物や動物の隣に別の滅菌フィールド上の機器に滅菌フィールドを置きます。 </li><li>手術用メスの刃＃10で皮膚を切開。止血クランプで筋肉組織をはがし。腹臥位の位置に動物を配置します。止血クランプ位置の胸の開創と胸壁を開きます。止血クランプで開く心膜。 </li><li>連続した心筋組織を通過し、下降冠状動脈の周りの冠動脈閉塞、ループ360ミリメートル長4-0絹縫合糸を製造することができます。 14G 1.25 cmの長さのプラスチックチューブに絹縫合糸の両端を挿入します。 </li><li>絹縫合糸と膿の両端を引いhは動脈に対するダウンチューブを40分間、それを閉塞します。止血クランプでプラスチックチューブをクランプすることによって閉塞を固定します。 </li><li> 40分後、フレキシブルチューブ、絹縫合糸を除去した止血クランプを、解放することによって閉塞を解除します。 注：シャム対照ラットには同じ外科的処置のマイナス冠状動脈の閉塞を受けます。 </li><li>胸壁を閉じる前に、気胸を防ぐために、5 mlのシリンジを用いて胸部から空気を描画するために胸腔を通して柔軟なカテーテル（18G 4.5センチ）を配置。 </li><li> 2-0縫合糸で閉じる胸部空洞、4-0絹縫合糸と3-0絹縫合糸で皮膚と筋肉をステッチ。 </li><li>最後のスキンポイントを閉じる前に、再び胸部キャビティ内にあらかじめ配置されたカテーテルを通して5 mlのシリンジを用いて胸部から空気を引き出します。 </li><li>最後のスキンポイントを縫合。イソフルラン換気を停止します。 </li><li>ラットの覚醒を監視します。それはregaineを有するまで無人の動物を放置しないでくださいD十分な意識は胸骨横臥位を維持します。 </li><li>鎮痛剤（ブプレノルフィン、0.05ミリグラム/ kg、腹腔内）で抗生物質（duplocillinの単回投与、0.2ミリグラム/ kg、腹腔内）でラットを24時間毎に8時間を扱います。 </li><li>手術後、家のラット個別に屠殺時まで、 すなわち 、3日後にMI。 </li><li>梗塞サイズ、主に壊死は、左心室の危険性のある領域における梗塞組織の割合として表されます。これは、トリフェニル着色11を用いて測定することができます。 </li></ol> 2.扁桃体の分離<ol><li>その鼻は狭い端部の開口部の外に突出して、円錐形のバッグの中に最初の動物の頭を置きます。あらゆる動きを避けるために、ラットを固定します。はさみの刃の間に、ギロチンに適切にその頭を置きます。動物の首を切ります。 </li><li>皿にラットの頭部を置き、砕いた氷の上に保持。砕いた氷（4℃）で組織分離のためのすべての手順を実行します。 </li><li>カットオープンSK慎重に引き上げと下の組織をmutilating回避することにより、骨鉗子で骨シースを切り離し、ハサミでULL。 </li><li>頭蓋骨の底部と脳の後部腹側表面との間にヘラの平らな刃を置き、慎重に脳をゆっくり外に持ち上げることができるようになるまで静かに頭蓋骨の底部に沿って前方に刃を押して、頭蓋骨から脳を切り離し頭蓋骨。頭蓋骨を捨てます。 </li><li>その背側表面に脳を置きます。視床下部（小脳の前の構造）を特定し、その前端の、その後端の前後に冠状脳をカット。他の用途のために必要とされていない場合、脳の前方および後方部分を破棄します。 </li><li>ちょうど次の視床下部に、左右対称に、側頭葉の下に小球としてamygdalasを視覚化。 </li><li>離れ実験者からの正面の端に脳フラットフリップ、背面。 </li><li>脳の左側または右側から開始します。ヘミを分離球体して、連続した扁桃体からの皮質。扁桃体の単離を可能にするために、この緩い皮質の方法8mm程度をカットします。メスで扁桃体を切り取ります。 </li><li>それ横切る暗い縫合糸に沿って切断することにより、そのcentromedial部分から扁桃体の基底外側の部分を分離し、ほぼ半々。この構造は、常に容易に識別ではありません。 </li><li>個別の識別されたバイアル中に扁桃体のサブパーツを入れて、砕いた氷の上におきます。 </li><li>他の半球で解剖手順を繰り返します。 </li><li> 1分間液体窒素中でバイアルを浸し。必要になるまで-80℃の冷凍庫にバイアルをしてください。 </li></ol> 3.カスパーゼ-3活性<ol><li>スクロースの0.32 Mで溶解緩衝液を調製し、1％トリトンX-100、トリス-HCl、pH8の10mMのエチレンジアミン四酢酸の5 mMのジチオスレイトール、2 mMの、フェニルメチルスルホニルフルオリド1mMの、ロイペプチン10μgの/μL 、ペプスタチンAの10μgの/μLおよびアプロチニン10μgの/μL。 </li><li>各サンプル（5〜10mgの）に溶解バッファー150μlのを追加します。氷の上に保管してください。最大強度（40 W）で5秒間、氷上で超音波処理し、各サンプル。 30分間氷上で溶解緩衝液中で組織をインキュベートします。 5分間、各サンプルをボルテックス。 </li><li>液体窒素および37℃に設定したサーモスタット制御加熱プレート上で交互にサンプルを配置することによって、3回の凍結/融解サイクルを行います。 13,000gで遠心組織（4 10分間°C）。注意深く上清を除去し、氷上でチューブに保ちます。 </li><li>ウシ血清アルブミンを0と10μg/ mlの間で標準的なタンパク質濃度を準備します。緩衝液のみで空白を準備します。 </li><li>各規格にBradford試薬200μlのを追加します。 595 nmにおける標準読みます。タンパク質レベルでは、蒸留水795μlのブラッドフォード試薬の200μlにサンプル上清の5μlを添加します。 595nmで各サンプルを読み、標準曲線を有するタンパク質を定量化します。 </li><li> 5mMのMgCl 2、50mMのトリス-HCl、pHが7、&lt;との反応緩衝液を調製します/サブ&gt;、エチレングリコール四酢酸1mMの、3-cholamidopropylの0.1％）ジメチル] -1-プロパン及びジチオスレイトール1mMの。 </li><li>正と負の反応サンプルを得るために反応緩衝液およびカスパーゼ3基質に25μgのタンパク質を追加します。負のサンプルについて、25μgのタンパク質は、AC-DEVD-CHO 800μMの0.4μLとのAc-DEVD-AMCの10mMの0.8μlを、反応バッファーを追加します。正のサンプルでは、​​反応緩衝液に25μgのタンパク質とのAc-DEVD-AMCの10mMの0.8μlを添加します。三重ですべての負と正のサンプルを処理します。反応緩衝液を添加することによって、200μlのまで各試料の最終容量を完了します。 </li><li> Ac-DEVD-CHO 800μMの0.5μL、0.8μLのAc-DEVD-AMCの10mM、溶解緩衝液の10μlに反応緩衝液の188.7μLを追加することで、ネガティブコントロールを生成します。陽性対照のために、反応緩衝液189.2μlのAC-DEVD-AMCの10mM、溶解緩衝液10μlを0.8μlを添加します。 </li><li>サンプルをインキュベートし、37 O℃で3時間暗所でのコントロール</li><li>各サンプルとコントロールに600μlのグリシン、0.4MのNaOHと0.4 M（pHが10）との反応を停止します。 </li><li> 465ナノメートルの波長365nmおよび発光波長の励起波長で蛍光分光分析によって蛍光を定量化します。ガラスキュベット中の反応に2mlの蒸留水を追加します。各秒に1点で10秒間コントロールとサンプルをお読みください。 </li><li>各試料中の特定の活動を定量化：（陰性サンプルマイナス陽性サンプルの蛍光（蛍光）2.8ミリリットルの容量をX）（タンパク質25ミリグラムのインキュベーション3時間のX量の時間）で割りました。 </li></ol>

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M., Godbout, R., Lakshmanadoss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19,+Post-Myocardial+Infarction+Depression.">Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression.</a> Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . , 333-362 (2012).</li><li>Wann, B. 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著者らは、開示することは何もありません。

過去10年間で、このプロトコルでの経験は重要な方法論的問題の同定につながりました。まず、砕氷上にペトリ皿の急速な脳の解剖は、準備の品質を維持することが重要です。第二に、組織の超音波処理は、心臓（10秒）のような組織、または腎臓の他のタイプ（20秒）に比べて脳の扁桃体のために短いことが実現されなければなりません。第三に、細心の注意を注意深くサンプルに追加する前に、基材を混合するために取られるべきです。混合順序が不十分であったときに我々は変数の信号を検出しました。サンプルを読み込むときに第四に、気泡は石英セル中に存在してはなりません。そうでなければ、信号を変更することができます。 1μL未満の容量を回避するために、基板のボリュームを増やす：私たちは、結果の再現性を高めるために、ここ数年の変化をしました。それでも、小さな変動は、連続アッセイ間で発生する可能性があり、少なくとも3対照試料に使用されるべきですバリエーションの制御。これらのコントロールの蛍光測定値を平均化し、平均値を100％に設定されています。実験試料中の蛍光測定値は、対照サンプルの割合に変換されます。 技術の他の限界は、組織の一部のみが使用されることがあり、したがって、カスパーゼ3活性を過小評価することができます。実際、アポトーシスの時間ウィンドウは、任意のセル内の短絡であり、それは1,4,15サンプリング時に隣接する地域で発生しても見逃すことができました。その逆も可能です：アポ​​トーシスは、カスパーゼ3活性の過大評価、その結果、組織の部分に特に強烈である可能性があります。当社は、TUNELアッセイまたはバックス/ Bcl2の比（概要を参照してください）​​などの補完的な技術、の残りの組織（扁桃体）の使用をお勧めします。 蛍光分光分析は、ウエスタンブロット法に比べて少なくとも2つの利点があります。まず、直接定量的データを生成します。第二に、酵素Aを測定しますctivity自体ではなく、無関係であってもよく、それは、タンパク質の発現は、酵素活性の変化なしに増大させることができることが知られているタンパク質またはRNA発現。また、分光蛍光分析は、他の組織または異なる動物種を用いて実施することができ、安全な比較を行うことができるように、別の基質と、他のカスパーゼのサブタイプのために調整することができます。 結論として、このドキュメントでは、アポトーシスが3日、MI後大脳辺縁系のこの領域で発生することの証拠を提供し、扁桃体におけるカスパーゼ3活性を測定する分光分析の使用方法を示しています。

カスパーゼまたはシステイン依存アスパラギン酸指向プロテアーゼは、さまざまなホメオスタシスprocessess 1に関与している酵素のファミリーです。カスパーゼは広くアポトーシスまたは炎症における役割に応じて分類することができます。カスパーゼ-1、-4、-5およびアポトーシスに従事したものは、イニシエーターカスパーゼ（カスパーゼ-8および-9）と実行カスパーゼとしてサブ分類することができるのに対し、-12は、炎症に関与している（カスパーゼ-3、-6および-7 ）。 カスパーゼは、心筋梗塞（MI）または脳虚血後に観察されたように、主にアポトーシスが過剰であることができる疾患には、多くの病態において重要な役割を果たしています。 私たちの研究室で使用され、MI後症候群のラットモデルでは、カスパーゼ3が心筋2にも、気分や感情3-6の制御に関与している大脳辺縁系だけでなく活性化されることが確立されています。それはまた、カスパーゼ-3は異なる領域で活性化されていることがわかります大脳辺縁系の、そのような扁桃体や海馬、および虚血発作4の3日後の周りのこの活性化ピークとして。興味深いことに、カスパーゼ3活性は、MI後の行動障害と相関し、薬理学的および栄養介入を通じて、減衰はカスパーゼ3および心筋梗塞後のうつ病7-12の間の可能なリンクを示唆し、これらの傷害を軽減します。 カスパーゼ-3の活性化は様々な技術によって測定することができます。ウエスタンブロット法は、カスパーゼの酵素特性を把握し、活性酵素、ならびにそれらのプロ酵素の形態を検出することができます。ウェスタンブロッティングは、しかしながら、半定量的であり、小さな変動は、弱い信号対雑音比13を介して失われることがあります。より良い手法は、蛍光性化合物を放出し、分光分析により測定することができるカスパーゼ-3による基質（DEVD-AMC）の開裂に基づきます。カスパーゼ-3の活性化は、アポトーシスの信頼できるマーカーです。アポトーシスCAの測定nは発生の時間ウィンドウが短いため、不安定であること、及び隣接セルのアポトーシス体またはセル 14 を貪食できました。アポトーシスは、さらに、例えば、Baxのようにアポトーシスのシグナル伝達カスケード6、または抗アポトーシス/プロタンパク質の比から得られたDNA断片を検出するターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識（TUNEL）アッセイ、/のような他の技術によって確認することができますBCL2 6。

<table><tbody><tr><td>Spectroflurometer</td><td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>with DeltaRAM&amp;nbsp; Random Access Monochromator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Harvard apparatus</td><td>683</td><td>small animal ventilation</td></tr><tr><td>Glass cuvette</td><td>NSG precision cells</td><td>3G10</td><td>Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&amp;nbsp; series</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

心筋梗塞（MI）は、生理学的および行動レベルでの劇的な中・長期的な影響を持っていますが、関与するメカニズムはまだ不明です。私たちの研究室では、損なわれた心機能、大脳辺縁系におけるニューロン喪失、認知障害とうつ病の行動の兆候が表示され、MI後症候群のラットモデルを開発しました。 MI後の3日目にピークに達し - ニューロンのレベルでは、カスパーゼ3活性化は、扁桃体などの異なる辺縁地域で心筋梗塞後のアポトーシスを仲介します。認知および行動障害は、MI後2-3週間表示され、これらは、カスパーゼ3活性の測定値と統計的に相関しています。ここで説明するプロトコルは、MIを誘導する扁桃組織を収集し、分光分析を用いてカスパーゼ-3活性を測定するために使用されます。 MIを誘導するために、下行冠状動脈を40分間閉塞されます。ラットを屠殺し、扁桃体は、RAPIを単離した：カスパーゼ-3活性化を評価するためのプロトコルは、3日後に開始するMI脳からDLY。サンプルは、すぐに液体窒素中で凍結させ、実際の分析まで-80℃で保存されています。カスパーゼ3活性化を評価するために実行される手法は、分光分析によって測定することができる蛍光性化合物を放出するカスパーゼ-3による基質（DEVD-AMC）の開裂に基づきます。方法は、定量的および再現可能であるが、必要な機器は高価であり、サンプルを定量するための手順は、時間がかかります。この技法は、心臓や腎臓のような他の組織に適用することができます。 DEVD-AMCは、他のカスパーゼの活性を測定するために、他の基板に置き換えることができます。

扁桃体8偽（対照）および三日虚血/再灌流プロトコルの誘導後8 MIラットで単離しました。カスパーゼ3活性は、活性カスパーゼ3によって切断され、分光分析によって検出することができる蛍光色素を使用して、この組織で測定しました。正および負の測定値は（ステップ3.11、3.12と3.16を参照）は、各秒で1ポイントと、10秒の間に三連で実施し、測定しました。陽性対照および陰性対照の間の差を計算し、この実験中に行われたすべての偽の組織に対する差の平均を100％に設定しました。 MIラットからの結果は、この参照に従ってスケーリングされ、 図1は、最終的な結果を示しています。それは、偽（P &lt;0.05）に比べてMIラットで有意に高い活性を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> 図1.カスパーゼ3MIラットの扁桃体の活動は、100％（1群あたり8匹）に設定され、偽のコントロールの平均活性のパーセンテージとして表しました。 *重要な群間差（p &lt;0.05）を示します。データは平均±SEMとして表されます。

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Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

心筋梗塞後の分光分析により測定したラットの扁桃体におけるカスパーゼ-3活性

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K ビュー.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

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Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

ラットにおける急性心筋梗塞

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

医学

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

生化学

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

ラットにおける慢性心筋梗塞の組織学的定量

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを用いたマウス心筋梗塞モデル

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial infarction (MI). However, the disadvantages of this model include high mortality rate after ligation and larger variations both in the infarct size and the degree of impaired cardiac function. In addition, a ventilator or exteriorization of the heart is indispensable for the previous models, which complicates the procedure during the ligation. In this study, we developed a reliable and reproducible model without the ventilator or exteriorization of the heart by ligating the LAD coronary artery. Four weeks after the procedure, we found that the serum concentrations of CK-MB, NT-proBNP, and Renin, which were used to assist diagnoses of MI and HF, were significantly higher in the MI group compared to the sham group. In contrast, the value of left ventricle ejection fraction (LVEF) in the MI group was obviously less than in the sham group. Furthermore, the infarct size and cardiac fibrosis area were individually confirmed and quantitatively analyzed by TTC staining and Masson's trichrome staining. Smaller variations were found in either infarct size or fibrosis area in the MI group, which helped to develop a reliable and reproducible model of HF post-MI. This new model of HF post-MI in the rat is vital for studying the potential mechanisms of MI and HF. This new method can be used to develop the new drug for treatment of MI and HF in rats by using pharmacological strategies.

We successfully developed a reliable and reproducible model of heart failure post-myocardial infarction in the rat without ventilation or exteriorization of the heart. This simplifies the procedure and benefits the further studies about the potential mechanisms behind the heart failure.

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

無傷心膜虚血性げっ歯類モデル

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

<meta charset="utf8"></head><body>ラットMCAO脳卒中モデルにおける細胞死を研究するための免疫蛍光染色

Evaluating Cell Death Signaling by Immunofluorescence in a Rat Model of Ischemic Stroke

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery (MCA). Current pharmacological approaches for the treatment of ischemic stroke are limited; therefore, novel therapies providing effective neuroprotection against ischemic injury following stroke are urgently needed. In the brain tissue following ischemic stroke, the area of the ischemic penumbra is salvageable but at risk of progressing to irreversible damage. The penumbral area surrounding the infarcted core is a conceptual target for neuroprotection. Since the blood flow is partially maintained in the penumbral area, neuronal and non-neuronal cells in this area transiently survive after stroke, and these cells that are still viable may be rescued by appropriate medical interventions. Understanding the pathophysiology of the penumbra is important in the development of neuroprotective therapies because the cell death pathways activated in the ischemic penumbra may indicate therapeutic targets, such as RUNX1 and cathepsins. These protein targets functioning as mediators of programmed cell death can be further exploited in translational research. With moderate size and similarity to the human brain, the in vivo rat model of MCA occlusion (MCAO) mimics the human ischemic stroke and offers an applicable tool to investigate the penumbral pathology, examine the cell death signaling, and evaluate the effects of potential targets in the context of MCAO. Here, we describe how to induce MCAO in rats and how to perform immunofluorescence staining for the detection of cell death signaling in the rat brain following MCAO.

<meta charset="utf8"></head><body>虚血性脳卒中のラットモデルにおける免疫蛍光法による細胞死シグナル伝達の評価

Rat in vivo models are indispensable tools to investigate the pathological mechanisms and therapeutic targets for ischemic stroke. This work will describe performing immunofluorescence staining in infarcted brain slices following middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats.

虚血性脳卒中のラットモデルにおける免疫蛍光法による細胞死シグナル伝達の評価

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery ...

心筋梗塞後の分光分析により測定したラットの扁桃体におけるカスパーゼ-3活性

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ラットにおける急性心筋梗塞

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

ラットにおける慢性心筋梗塞の組織学的定量

左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを用いたマウス心筋梗塞モデル

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

無傷心膜虚血性げっ歯類モデル

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

虚血性脳卒中のラットモデルにおける免疫蛍光法による細胞死シグナル伝達の評価

虚血性脳卒中のラットモデルにおける免疫蛍光法による細胞死シグナル伝達の評価