我々は博士に感謝します。生体顕微鏡に関する命令のアラタ田淵とWolfgangキュブラー（トロント大学）。私たちは、顕微鏡の設計と実装を支援するためのアンドリュー·ケーヒル（ニコンインスツルメンツ）に感謝。この作品は、NIH / NHLBI助成P30 HL101295とK08 HL105538（EPSまで）によって賄われていた。

1。手術チューブ、血管カテーテル、胸壁窓の調製<ol><li> 生体顕微鏡ステージ。我々は麻酔マウスが顕微鏡の間にあるその上にプレキシガラスステージをカスタムメイド。このステージは、10cmフレキシブルなプラスチックまな板（マウスが麻酔導入、気管切開の配置、および静脈カテーテル中にあるその上に）だけでなく、同​​様のサイズの発熱体（まな板の下に位置する）で15 CMの両方に対応しています。 </li><li> マウス胸腔チューブの調製 （ 図1）。 PE50チュービング（Intramedic、内径0.58ミリメートル、外径0.965ミリメートル）の10 cmの長さをカットしています。一端が湾曲した23ゲージの針の鈍端部に取り付けられ、この針は、胸部窓の閉鎖の前胸壁（→外側内側）からチューブを渡すために使用されます。 チューブの先端（長さ1.5cm、付属の23ゲージに反対針）が繰り返し胸腔内の空気の効果的な吸引を容易にする &quot;サイドポート&quot;を作成し、30ゲージ針によって穿刺されています。 この有窓部分は、その後4時絹縫合糸のいくつかの円周ループによってチューブの残りの部分から分離され、これらのループは、最終的には胸腔内に穿破部分を1.5 cmのアンカー、 &quot;ストッパー&quot;として機能します。 </li><li> 頸静脈カテーテルは、PEチューブ10（Intramedic、内径0.28ミリメートル、外径0.61ミリメートル）の2つの15cmの長さがカットされています。メスはそれによって静脈穿刺の容易さを増加させる、ベベルに管の端部に使用されます。チューブはチューブの非面取り端部に取り付けられた6パーセント150 kDaのデキストラン溶液（PBS中）を含む1mlシリンジを介してフラッシュされます。 </li><li> 胸壁ウィンドウ準備します（図2）。透明ビニリデン膜（新呉ラップ、Kuresha、東京）が楕円形（長径6cmの短径4cm）ににカットされる。円形の5ミリメートル第1カバースリップ（Bellco）は、α-シアノアクリレート系接着剤を用いた膜（Pattexflüssig、ヘンケル、デュッセルドルフ）に貼付されています。 </li><li> 気胸の誘導のためのチューブ（ &quot;ブロー管&quot;）チューブの長さ10cm（内径3mm、外径5 mm）を5mlの注射器に接続されている;反対側の端部は、動物の胸郭内に空気を導入するために使用されます胸壁ウィンドウ移植に先立って。 </li><li> 目的の水浸用注射器23ゲージの針を蒸留水を含む30mlの注射器に取り付けられています。針の先端が目的の損傷を防止するために、（金属·ファイルを使用して）平滑末端化されています。 </li></ol> 2。マウスの麻酔<ol><li>マウスは、グラムマウス体重当たり8μlの用量で腹腔内投与しケタミン（10 mg / ml）とキシラジン（2 mg / ml）を混合物で麻酔です。鎮静は3内で発生 - 6分と自発呼吸を妨げてはならない。 </li><li>電気かみそりを使用して、ひげをそる喉、胸部、腹部、マウスの右側。 </li><li>テープを使用して、薄いプラスチックのまな板にマウスを固定します。マウスの頭部は、オペレータ（ 図3）に向かって指している必要があります。上の歯の下を通過縫合糸のループが提供する穏やかな緊張が頭拡張を維持するように働く。まな板は、気管切開、静脈カテーテル留置中にマウスの覚醒を維持し、加熱パッドの上に置かれている。 </li><li> 100％エタノールでウェット剃りエリア。 </li><li>テール/足ピンチで十分な麻酔を確認します。最小応答場合の処理​​;ケタミン/キシラジンの余分なボーラス十分に麻酔していない場合を示します。 </li></ol> 3。気管開口術<ol><li> 1cmの切開が喉を介して行われます。下層の結合組織を切開され、唾液腺を分離し、横方向に反映されます。気管のすぐ前方胸骨舌骨筋を切除されています。 </li><li>四時縫合糸のループが目の下に進められる電子気管（ 図4）。ループは、気管の根底に縫合糸の2つの別々の鎖を作成し、切断されている。尾縫合糸は、気管切開チューブを固定するために使用されます;頭蓋縫合は気管切開の配置中に気管の張力を提供するために使用されます。 </li><li> 2本の指を使用して、上部の縫合が把握されており、穏やかな張力が気管に適用されます。水平切開は、上下糸の間の気管内に作られています。この切開は気管の円周の約3分の2を越える必要があります。フランジ付き気管切開チューブ（ハーバード装置、1.22ミリメートル外径）は、遠位気管に挿入し、尾気管縫合糸を用いて、所定の位置に固定されています。 </li><li>気管切開は、ボリューム制御の小動物ベンチレーター（インスピラ、ハーバード装置）に接続されており、マウスは40％吸入酸素と9 ml / kgを一回換気量（設定は我々の研究室では十分な酸素/換気を維持するために最適化された）で換気される。ポジtive呼気終末陽圧（PEEP）がこの時点で始まっていません。注目すべきは、人工呼吸器の設定は、個々の研究室の中でユニークな条件に最適化する必要があります。冗長チューブ（人工呼吸器のチューブをYコネクタと気管切開の間に介在さ）の異なる長さは任意の選択された一回換気量の安定した肺胞換気量を確保し、デッドスペースを調整するために使用することができます。 </li></ol> 4。静脈カテーテル法<ol><li>内部および外頸静脈の接合部は、近位、遠位静脈枝を追跡することによって同定することができる。外頸静が反映唾液腺の下に発見されたが、これは外部頸静接合を見つけるために近位にさかのぼることができます。 </li><li>周囲結合組織から頸静接合を分離するために穏やかな鈍的切開を使用しています。 </li><li>四時の縫合糸を使用し、頸静脈に合流（頭蓋）遠外頸静脈と頸静脈を結紮する。 </li><li>気管分岐部に小切開を加える頸静接合の、出血は最小限であるべきです。 </li><li> 2つのカテーテルは、増分切開を通して、頸静脈幹に前進させることができる。返血を確実にするために穏やかな吸引後、カテーテルは午前4時の縫合糸を用いて静脈内に固定される。 </li><li>テープ静脈偶発脱落を防止するには、まな板にカテーテル。 </li></ol> 5。生体マウス肺顕微鏡手術（田渕らから適応18） <ol><li>まな板は（拘束、麻酔マウスと同様にテープ静脈カテーテルを含む）残りの外科的介入が実行される生体顕微鏡のステージに移行します。直腸温度プローブが配置され、このインタフェースを適応加熱システム（まな板の下にあります）で、マウスの覚醒の維持を可能にします。 </li><li>一頚静脈カテーテルはケタミン（10 mg / ml）を、キシラジン（2 mg / ml）を実現し、シリンジポンプに接続されている時間当たり200μlで混合。十分な麻酔が再びテール/足ピンチを使用して確認された。 </li><li>正中切開します（ 図5）の右側に横方向に進む、xyphoidプロセスに首から拡張されています。 </li><li>電気メスを使用して、胸の筋肉は胸郭を露出して、削除されます。ケアは、完全な止血を確実にするために取られる。 </li><li>ダウン左側とテープの上にマウスの右hindlegを渡ります。その結果腹部ねじり、手術のしやすさを向上させ、わずかに胸部を回転させます。 </li><li> 45度の角度（ 図6）でステージを配置し、この位置では、気胸が誘導されると、肺は胸壁から落下することができます。 </li><li> 1回目のリブ（最も劣っリブ）が鉗子で把持して上昇させ、湾曲した鉗子はぶっきらぼうに肋骨の下に押し込まれる。これは胸壁から壁側胸膜を分離します。胸膜はunpuncturedままにしてください。 </li><li>ブローチューブとを用いて注射器、空気が強制的に壁側胸膜に対して導入される。これは、基礎となる肺を損傷することなく、胸膜表面と気胸の破裂につながります。基盤となる肺は、肺を損傷することなく、電気メス、鉗子の導入を可能にする、胸の壁から落下します。人工呼吸換気量の減少は、通常、このステップの間に必要とされない。 </li><li>電気メス、鉗子を使用して、胸壁の筋肉組織を解剖し、胸壁に〜8ミリメートル円形の穴を開け、5 番目と6 番目のリブ/壁側胸膜を横切る。出血の存在は顕微鏡（ 図7）が不明瞭になりますようにそれは、完全な止血を維持することが不可欠です。 </li><li>針ドライバを使用して、胸壁の穴に胸腔ドレーンを挿入します。針は、穿刺胸壁と胸郭ウィンドウ（ 図7）に劣ると横胸腔を終了する必要があります。ダイアフラムを刺さないように注意してください。ザその抵抗は、管の有窓部の縁に位置して縫合糸 &quot;ストッパ&quot;から発生するまでチューブをゆっくり胸壁から引き出される。 </li><li>ステージは平坦な場所。 </li><li>肺reexpansionを役立てるための人工呼吸器から3cm H 2 OのPEEPを追加します。 </li><li>接着剤（Pattexゲル、ヘンケル）は胸ウィンドウの周りに円周に配置されます。膜が胸腔に外部に面するガラスカバースリップと、装着されている。慎重に（と円周方向に）おおよその綿棒を使用して接着剤への膜。 </li><li>肺リクルートメント手技（PEEPの換気装置のポートが閉塞​​されている間の3回換気量）を実行している間、-3ミリメートルHgの吸引は胸管に適用されます。肺は自由に潮換気（ 図8）の間に移動させながら、持続的に近似膜べき。 </li><li>マウスの右前足は、マウスの左側臥位で、その結果、左側に渡っています。スポンジウェッジは胸ウィンドウが顕微鏡水浸対物レンズと位置合わせされるように適切にマウスを配置するために使用することができます。 </li><li>蒸留水は、水浸対物レンズを用いた肺の可視化を可能にする、顕微鏡の前にカバースリップ上に配置されます。水が断続的にイメージングを通して補充する必要があります。 </li></ol> 6。肺内皮表面層の厚さの測定<ol><li>直ちに胸壁閉鎖後、500μlのFITC標識150 kDaのデキストラン（PBS中6％溶液）を第二（非麻酔）頚静脈カテーテルを介して投与される。このボーラスは、ボリューム蘇生だけでなく、ESLの測定のための血管トレーサーとして機能します。デキストランボーラスは、好中球の接着や肺浮腫形成2には影響しません。 </li><li>水浸対物レンズは、カバーガラスの上中央に配置されます。目標の選択が不可欠である-ESLの厚さのわずかな違いは、高numeriを視覚化まだ2を維持したままCAL絞りが（&gt; 0.8）が必​​要です - 3 mmの作動距離（肺ウィンドウおよび胸膜表面の貫通が可能）。我々は、この目的のためにニコン、CFI 75 LWD 16倍（NA 0.8）とCFI 75 LWD 25倍（NA 1.1）の目標を使用しています。 </li><li>正確に動く臓器のESLの厚さを測定するためには、明視野、蛍光血管の幅が同時に行われることが不可欠である。これは、反射光微分干渉コントラスト（DIC、明視野）およびFITC画像（ 図9）の同時キャプチャが可能イメージスプリッタ（デュアルビュー、Photometrics）を使用して達成することができる。 </li><li> 5秒吸気ポーズ中、連続撮影が行われ、記録されます。後で、これらの画像は合焦フレームを識別するために見直される可能性があります。 </li><li>合焦枠、胸膜下の微小血管を（&lt;20μmの直径）を使用すると、識別され、少なくとも3つの微小血管は、通常、単一のフレーム上に発見されています。実験終了後、DICとFITC-デキストラン血管の幅が微小血管ごとに3つの垂直切片の長さを平均化することにより、（盲検観察者による）を測定する。代表的な結果セクションで説明したように、容器の両端に等しいESLの厚さを仮定して、ESLのサイズは、DICおよびFITC-デキストラン血管幅の間の半分の差によって定義することができます。 </li><li>通常、生体顕微鏡、肺傷害や低血圧2のいずれかの証拠もなしに&gt; 90分間行うことができます。予備実験では、観測期間中にマウスの安定（血圧、酸素化、換気、肺傷害）を確認するために実行する必要があります。実験的な薬は、手順中のどの時点でも第二（非麻酔）頸静脈カテーテルを介して導入することができる。 </li></ol> 7。肺内皮表面層の整合性の代替測定無傷の内皮表面層の機能は、（部分的に）circulatを除外する内皮表面2から要素をING。 ESLの整合性は、したがって、細胞表面接着分子（ICAM-1など）にアクセスし、対話するための循環要素の能力（蛍光ミクロスフェアなど ）によって測定することができる。 <ol><li>抗ICAM-1標識した蛍光マイクロスフェアは、手術前に用意されている。ストレプトアビジンでコーティングした0.97μmの蛍光マイクロスフェアは、室温で30分間、ビオチン化抗ICAM-1（YN1/1.7.4クローン、1:50、eBioscience社）抗体またはアイソタイプコントロールと共にインキュベートする。ミクロスフェアは、3回洗浄し、ml当たり1×10 9ミクロスでPBSに懸濁する。 </li><li>生体顕微鏡検査の間に、マイクロスフェア懸濁液（100μl）を頚静脈カテーテルに注入される。循環の15分後、蛍光画像を5分かけて捕獲される。 &gt; 5分間動かないマイクロスフェアは、付着し、画像処理ソフトを用いて定量化とみなされます。 </li></ol> 8。安楽死 &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;手続きが完了した後、麻酔したマウスは、直接心臓穿刺を介して放血により安楽死させています。安楽死は肺を後の分析のために採取して瞬間凍結されてからの二国間気胸を介して確認された。

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特別な利害関係は宣言されません。

生体顕微鏡検査での利用拡大と一致し、ESLの実質的な大きさだけでなく、血管機能への多くの貢献の両方の増加感謝があります。これらの新たなデータは、しかし、主に全身の血管系の研究から派生しています。確かに、肺で生体顕微鏡での使用は重大な肺と心臓の動きのアーチファクトを考えると、技術的に困難である。 最近のいくつかの?...

内皮グリコカリックスは、血管内膜を裏打ちするプロテオグリカンおよび関連するグリコサミノグリカンの細胞外の層です。 生体内では、グリコカリックスは、高度に水和され、流体透過性1を含む内皮様々な機能を調節する実質的な内皮表面層（ESL）を形成し、好中球の内皮接着2、および流体せん断応力3のメカノ。 歴史的に、グリコカリックスは、標準的な組織固定し、処理6時に培養された細胞調製4,5、およびその分解に起因し、そのaberranceに過小評価されています。増加は生体顕微鏡の7（ 生体顕微鏡検査で 、IVM）を使用し、健康と病気の間に血管機能にESLの重要性の高まり科学的関心と一致した。 ESLは、光学顕微鏡には見えませんし、簡単にラベルを付けることができません赤血球凝集8と致命的な肺塞栓（未発表の観察）を引き起こす蛍光グリコカリックス結合レクチンの性癖与えられたin vivoで、。いくつかの間接的なアプローチは、したがって、そのような精巣挙筋および腸間膜microcirculationsとして非移動血管床にESLの厚さ（と、拡張による、グリコカリックスの整合性）を推定するために開発されている。これらの技術は、内皮細胞膜（微粒子画像流速9）と同様に内皮表面からかさばる、蛍光標識された血管マーカー（ 例えばデキストラン）の排除の測定からの距離の関数として微粒子速度を循環さの違いの測定を含む（デキストラン除外手法10、11）。これらの技術のうち、デキストラン除外とは、ある一時点で測定した値からESLの厚さを推定することができる。同時に明視野顕微鏡（の幅を使用して血管の幅を測定することにより、&quot;見えない&quot; ESL）とESLから除外血管トレーサーの蛍光顕微鏡のclusive、ESLの厚さは、血管幅2間の半分の差として計算することができます。 ESLの厚さの瞬間的な尺度の使用は肺糖衣の研究に適しています。肺の生体顕微鏡検査は重要な肺と心臓の動きのアーチファクト与えられ、やりがいがあります。最近の進歩は 、in vivo 12、13 にマウス肺の固定化を可能にしているが、懸念は、肺うっ血の生理学的影響について存在する。肺の不動は14のシグナリング減少内皮一酸化窒素、好中球の接着15と肺損傷16の両方に影響を与えるシグナル伝達経路に関連付けられています。さらに、肺の面積の固定化は、古典的な生理学的な概念による有害なせん断力（ &quot;atelectraumaいわゆる&quot;）にモバイル胞を取り巻く公開肺胞の相互依存17。 2008年、磯崎田淵、ヴォルフガング·キューブラーらが自由に動いてマウス肺18の生体内顕微鏡を可能にする手術法を開発しました。この手法から生じる呼吸アーティファクトは明と蛍光顕微鏡の同時測定など、高速イメージングの使用によって否定することができます。瞬時デキストラン除外イメージングは、生体内で 、自由に行動しているマウス肺の胸膜下微小循環のESLの厚さを測定するために用いることができる方法このレポートでは、我々は詳細。この手法は、簡単に、糖衣機能特異内皮表面から循環要素を除外するために無傷ESLの能力を決定するように変更できます。我々は最近、敗血症2などの全身性炎症性疾患時の急性肺損傷の発展に肺ESLの保全の重要性を決定するためにこれらの技術を使用している。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬の名称 </td></tr><tr><td> FITC-デキストラン（150 kDa）の</td><td>シグマ</td><td> FD150S </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-デキストラン（150 kDa）の</td><td>シグマ</td><td> T1287 </td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジンでコーティングされた蛍光ミクロスフェア</td><td>前髪研究所</td><td> CP01F/10428 </td><td>ドラゴングリーン蛍光（FITCに似ています） </td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>ムーアメディカル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>ムーアメディカル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗ICAM-1抗体のビオチン化</td><td> eBioscience社</td><td>クローンYN1/1.7。4 </td><td> 1:50希釈</td></tr><tr><td>アイソタイプビオチン化抗体</td><td> eBioscience社</td><td> IgG2bでeB149/10H5 </td><td> 1:50希釈</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>人工呼吸器</td><td>ハーバード装置</td><td>インスピラ</td><td></td></tr><tr><td>気管切開カテーテル</td><td>ハーバード装置</td><td> 730028 </td><td></td></tr><tr><td>電気焼灼装置</td><td> DREの医療</td><td>のValleylab SSE-2L </td><td></td></tr><tr><td>バイポーラ焼灼鉗子</td><td>オルセンメディカル</td><td> 10-1200I </td><td> 9.9センチメートルマクファーソン</td></tr><tr><td>温度controlシステム</td><td>ワールド·精密機器</td><td> ATC1000 </td><td></td></tr><tr><td>注射器ポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>ポンプ11エリート</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡（広視野） </td><td>ニコン</td><td> LV-150 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡（共焦点） </td><td>ニコン</td><td> A1R </td><td></td></tr><tr><td>イメージスプリッタ</td><td> Photometrics </td><td> DV2 </td><td></td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td> Photometrics </td><td> CoolSNAP HQ2 </td><td></td></tr><tr><td>画像処理ソフトウェア</td><td>ニコン</td><td> NISの要素</td><td></td></tr><tr><td>ビニリデン膜</td><td>呉WrをAP </td><td></td><td></td></tr><tr><td>円形のカバースリップ</td><td>ベルコ</td><td> 5CIR-1-BEL </td><td> 5ミリメートル、厚さ1位</td></tr><tr><td>接着剤（膜にスリップをカバー） </td><td> Pattex </td><td> Flussig（液体） </td><td>膜にカバースリップを固定するため</td></tr><tr><td>接着剤（マウスにスリップをカバー） </td><td> Pattex </td><td>ゲル</td><td>マウスに膜を取り付けるための</td></tr><tr><td>外科チューブ</td><td> Intramedic </td><td> PE50、PE10 </td><td></td></tr><tr><td>縫合</td><td>フィッシャー</td><td></td><td> 4時00絹</td></tr><tr><td>電気かみそり</td><td>オスター</td><td> 78997 </td><td></td></tr><tr><td>湾曲した外科手術用鉗子</td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストレート外科手術用鉗子</td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td>手術用のハサミ</td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科microscissors </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科用針ドライバ</td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td>サージカルテープ</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キッチンスポンジ（ウェッジにカット） </td><td>さまざまな</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer

内皮グリコカリックスは、血管の内腔を裏打ちするプロテオグリカンおよび関連するグリコサミノグリカンの層である。 生体内では 、グリコカリックスは、内皮機能の維持に寄与する実質的な内皮表面層（ESL）を形成し、高度に水和される。内皮グリコカリックスはしばしばin vitroでの異常であり、標準的な組織固定技術の間に失われているように、ESLの研究では、生体顕微鏡を使用する必要があります。肺胞毛細血管の最良近似複雑な生理機能に、肺の生体内イメージングは​​、理想的には自由に動いて肺に実行されます。これらの製剤は、しかし、一般的に大規模なモーションアーチファクト苦しむ。我々は自由に動いてマウス肺の開胸生体顕微鏡が内皮表面から蛍光標識された高分子量デキストランのESLの除外を介して糖衣の整合性を測定するために用いることができる方法を示しています。必要な場合に、この非回復手術手技、同時明視野とマウス肺の蛍光イメージングは​​、交絡肺損傷を誘発する証拠がなく胸膜下の微小血管系の長期的観察が可能になります。

手順1-6で説明した実験的なアプローチは、同時DIC（明）と蛍光像の複数のフレームのキャプチャが可能になります。 ESLの厚さを決定するために、記録された画像は、実験プロトコルの完了後に盲検観察者によって審査されます。合焦フレームを使用して、胸膜下微小血管（&lt;20μmの直径）が同定され、少なくとも3つの微小血管は、通常、単一のフレーム（ 図10）に発見されてい...

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In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

内皮グリコカリックス/内皮表面層は、理想的には生体顕微鏡を用いて研究されています。生体顕微鏡検査は、肺などの臓器に移動技術的に困難である。私たちは、同時明視野と蛍光顕微鏡を自由に移動させる際に内皮表面層の厚さを推定するために使用することができる方法を示してい<em生体内で&gt;</em&gt;マウス肺。

マウス肺内皮表面層の in vivo測定における

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

14.5K ビュー.  University of Colorado School of Medicine. 内皮グリコカリックス/内皮表面層は、理想的には生体顕微鏡を用いて研究されています。生体顕微鏡検査は、肺などの臓器に移動技術的に困難である。私たちは、同時明視野と蛍光顕微鏡を自由に移動させる際に内皮表面層の厚さを推定するために使用することができる方法を示していマウス肺。

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Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The proximal infrarenal aorta and the distal aorta are dissected for clamp placement and needle puncture, respectively. Special attention is paid to avoid dissection between the aorta and the IVC. After clamping the aorta, a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta into the IVC. The surrounding connective tissue is used for hemostatic compression. Successful creation of the AVF will show pulsatile arterial blood flow in the IVC. Further confirmation of successful AVF can be achieved by post-operative Doppler ultrasound.

The goal is to produce an arteriovenous fistula that is simple and reproducible. This method does not use sutures or glue adhesive. Therefore the samples can be used with the least amount of foreign materials for analysis.

マウスAortocaval瘻の技術的な側面

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

医学

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

ラットの肺転移における微小循環血流速度の自動測定

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Measurement of the Pressure-volume Curve in Mouse Lungs

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential phenotypic changes are best assessed by measurement of the changes in lung elasticity. To best understand specific mechanisms underlying such pathologies in mice, it is essential to make functional measurements that can reflect the developing pathology. Although there are many ways to measure elasticity, the classical method is that of the total lung pressure-volume (PV) curve done over the whole range of lung volumes. This measurement has been made on adult lungs from nearly all mammalian species dating back almost 100 years, and such PV curves also played a major role in the discovery and understanding of the function of pulmonary surfactant in fetal lung development. Unfortunately, such total PV curves have not been widely reported in the mouse, despite the fact that they can provide useful information on the macroscopic effects of structural changes in the lung. Although partial PV curves measuring just the changes in lung volume are sometimes reported, without a measure of absolute volume, the nonlinear nature of the total PV curve makes these partial ones very difficult to interpret. In the present study, we describe a standardized way to measure the total PV curve. We have then tested the ability of these curves to detect changes in mouse lung structure in two common lung pathologies, emphysema and fibrosis. Results showed significant changes in several variables consistent with expected structural changes with these pathologies. This measurement of the lung PV curve in mice thus provides a straightforward means to monitor the progression of the pathophysiologic changes over time and the potential effect of therapeutic procedures.

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung&#8217;s structural changes with developing pathology.

マウス肺における圧力 - 容積曲線の測定

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

マウス収縮圧力を測定するために子宮内テレメトリ<em&gt;インビボ</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

腫瘍の開発の評価のためのマイクロコンピュータ断層撮影を使用し、肺癌のマウスモデルでの治療に対する応答のフォローアップ

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

マウス網膜細動脈Ex Vivoでの反応性の測定の準備手順

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ultimately lead to new knowledge concerning the causes of or new ways to inhibit or treat plasma extravasation. It is important that researchers have the proper tools, including the best methods available, for studying plasma extravasation. In this article, we describe a protocol, using the Evans blue dye method, for assessing plasma extravasation in the organs of FVBN mice. This protocol is intentionally simple, to as great a degree as possible, but provides high quality data. Evans blue dye has been chosen primarily because it is easy for the average laboratory to use. We have used this protocol to provide evidence and support for the hypothesis that the enzyme neprilysin may protect the vasculature against plasma extravasation. However, this protocol may be experimentally used and easily adapted for use in other strains of mice or in other species, in many different organs or tissues, for studies which may involve other factors that are important in understanding, preventing, or treating plasma extravasation. This protocol has been extensively optimized and modified from existing protocols, and combines reliability, ease of use, economy, and general availability of materials and equipment, making this protocol superior for the average laboratory to use in quantifying plasma extravasation from organs.

In this article, an economical, optimized, and simple protocol is described which uses the Evans blue dye method for assessing plasma extravasation in the organs of FVBN mice that can be adapted for use in other strains, species, and other organs or tissues.

最適化されたエバンス ブルー マウス血管漏出を評価するためにプロトコル

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

Left Atrial Stenosis Induced Pulmonary Venous Arterialization and Group 2 Pulmonary Hypertension in Rat

The mechanism of mitral stenosis-induced pulmonary venous arterialization and group 2 pulmonary hypertension (PH) is unclear. There is no rodent model of group 2 PH, due to mitral stenosis (MS), to facilitate the investigation of disease mechanisms and potential therapeutic strategies. We present a novel rat model of pulmonary venous congestion-induced pulmonary venous arterialization and group 2 PH caused by left atrial stenosis (LAS). LAS is achieved by constricting the left atrium using a half-closed titanium clip. After the LAS surgery, a rat model with a transmitral inflow velocity greater than or equal to 2.0 m/s on echocardiography gradually develops pulmonary venous arterialization and group 2 PH over an 8- to 10-week period. In this protocol, we provide the step-by-step procedure of how to perform the LAS surgery. The presented LAS rat model mimics MS in humans and is useful for studying the underlying molecular mechanism of pulmonary venous arterialization and for the preclinical evaluation of therapies for group 2 PH.

Left atrial stenosis (LAS) is a novel surgical technique used for studying group 2 pulmonary hypertension (PH) and mechanisms underlying pulmonary venous arterialization. Here, we present a protocol to constrict the left atrium using a titanium clip to cause pulmonary venous arterialization and moderate PH in a rat.

左心房狭窄による肺静脈動脈化術とグループ 2 肺高血圧症ラット

The mechanism of mitral stenosis-induced pulmonary venous arterialization and group 2 pulmonary hypertension (PH) is unclear. There is no rodent model of ...