この方法は、特にアスピリンで治療されたリスクの高い患者において、アテローム血栓性プロセスの影響を受けやすい被験者を特定する血栓症および止血分野の主要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、それが安価で、使いやすく、便利で、高効率を有し、C924T多型の迅速な同定を可能にすることです。この方法は、アテローム血栓症分野への洞察を提供することができるが、薬理学的な個々の応答を理解するために、個別化された薬や特定の薬物を含む多型のような他のシステムにも適用することができる。
手順を実証するドクターセバスティアーノウルシ、私たちの研究室の技術者です。トリスEDTAバッファーをpH 8.0で調製するには、0.5モルEDTAの200マイクロリットルと1リットルのモルトリスクロリドをビーカーに加え、滅菌水で100ミリリットルに調整し、室温で保存します。次に、全ての試薬を加えて10Xストックの電気泳動バッファー溶液を1リットルずつ調製し、次にバッファーを室温で保存します。
次に、すべての試薬を添加してゲルローディング染料を調製し、滅菌水で100ミリリットルにボリュームを持って来ます。準備ができたら、数ヶ月間摂氏4度で染料を保管してください。10X TBEバッファーの50ミリリットルに450ミリリットルの水を加え、1X TBEバッファーの溶液を調製します。
アガロースゲル200ミリリットルを調製するために、1X TBEバッファーの200ミリリットルに4グラムのアガロースを600ミリリットルビーカーで一緒に加え、2%アガロースゲルを調製します。室温で保存された固化アガロースゲルは、沸騰水浴で15〜20分間、または少量の水を加えて35分間電子レンジで再溶解し、アガロース濃度の上昇を補うことができる。アガロースが懸濁されるまで約5分間磁気ミキサーでビーカーをかき混ぜ続け、アガロースをホットプレートで約10分間加熱するか、電子レンジで3分間加熱して完全に溶解します。
DNAを精製した後、チューブを数回ピペット化して新鮮なDNAサンプルを穏やかに混ぜます。ヒト試料から抽出した良質のテンプレートDNAを10~50ナノグラムで入手することが義務付けられている。このため、半自動または手動の精製ではなく、自動DNA精製を使用することを好みます。
精製を開始するには、まず260、280、320ナノメートルで吸収剤を測定してDNAの純度を定量し、計算し、次に滅菌水を用いてサンプルを希釈する。次に、分光光度計を較正する。PCR反応を構成するために、全ての試薬を添加し、0.2ミリリットルのマイクロ増幅チューブに25マイクロリットルのPCRマスターミックスを調製します。
次に、PCRチューブを自動サーモサイクラーに入れ、精製されたDNAサンプルを増幅します。プログラムが終了したら、4°Cでチューブを残して反応を停止します。DNAの遊離水に1マイクロリットル制限酵素あたり5単位の10倍の酵素バッファーを22.5マイクロリットルの体積に加えます。
次に、2.5 マイクロリットルの PCR 産物を新しい PCR チューブに加え、22.5 マイクロリットルの制限消化ミックスを PCR 産物に追加します。PCR製品制限消化マスターミックスを摂氏37度で4時間インキュベートし、1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの臭化エチジウムを加えてゲルを10分間染色します。ゲルを固めるために、ウェルコームを所定の位置に置いてゲルトレイにゲルを注ぎます。
ゲルが覆われるまで、1X TBEバッファーでゲルボックスを注ぎます。微細なヒントを使用して、ゲルに形成されたウェルに増幅された消化されたDNAの6マイクロリットルをロードし、サンプルと並行して別の方法でDNAマーカーを追加します。次に、電気泳動ユニットのスイッチを入れ、
TBXA2R遺伝子におけるC924T遺伝子多型を同定するために、RFLP分析が行われている。ゲルでは、主アレルの野生型バージョンに対して395および144塩基対で2つのバンドを表示する一方、マイナーアレルの変異型バージョンに対する539塩基対の単一バンドは制限酵素によるカットを示さないのが見られる。興味深いことに、395、144、および539ベースペアの3つのバンドがヘテロ接合アレーレのために存在しています。
次に、C924Tポリモーフィズムを配列解析を用いて確認する。強調表示されたシーケンスは、ポリモーフィズムを表します。一度習得すれば、この技術は、それが適切に実行されれば約8時間で行うことができます。
この手順を試みる際は、このメソッドは少数のスニップと、ワーキング セッションでの少数のサンプルに対してのみ使用できることを覚えておくことが重要です。この手順に従って、スニップ分析のような他の方法は、アテロームボミックプロセスを含む他の経路の重要性のような追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、分子生物学の分野の研究者がこの最初の発達と進行に顕著な遺伝的変異を探求する道を開いた。
このビデオを見た後、PCR-RFLPサンプルのゲル電気泳動解析を用いたC924T多型に関してトロンボキサンA2受容体遺伝子型を評価する方法をよく理解する必要があります。エチジウムブロマイドとUV光源を使用すると非常に危険であり、手袋、安全メガネ、フェイスマスク、その他の保護装置などの予防措置は、この手順を実行する場合は常に取り扱う必要があることを忘れないでください。
