ロドプシンの誤折は、網膜色素変性症と呼ばれる進行性網膜変性を引き起こす。従来のイメージング方法ではロドプシン輸送を定量化する能力は限られていますが、この新しく開発された画像ベースのアッセイは、高スループットスクリーニングを可能にし、偽陽性を排除します。この技術は薬物薬物力学の迅速な評価を可能にする。
疾患を引き起こすロドプシンの折りたたみを救い出す目では、静かに治療不能で盲目の疾患、網膜色素変性症の治療の可能性を加速させる。膜タンパク質の細胞の局在化は、その機能にとって非常に重要です。この方法は、容易に改変し、関心のある他の膜タンパク質の輸送を定量するために適用することができる。
プレートマップを用意し、プレートの各ウェルから液を静かに加えて吸引し、細胞間で細胞数と免疫状態状態を一貫した状態に保つようにしてください。これにより、高い Z 係数と信頼性の高い結果が得られます。まず、黒壁、透明な底、ポリリジン処理384ウェルプレートに井戸あたり5000細胞をシード。
細胞がプレートの底に付着するために3時間、5%のCO2でプレートを摂氏37度でインキュベートします。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、ここに示すような事前決定されたプレートマップに従って、5Xの作業溶液のウェルあたり10マイクロリットルを追加します。さて、2%DMSOのウェルあたり10マイクロリットルをカラム22と24に加えます。
また、薄暗い赤い光の下で暗い部屋のカラム23に25マイクロモル9-シス-レチナルのウェルあたり10マイクロリットルを加えます。各種試験化合物の全ての装填が終了したら、プレートをアルミホイルで覆い、24時間37°Cでインキュベートします。薄暗い赤い光で暗い部屋で384ウェルプレートを取り出します。
ここで、8チャネル吸引器を用いて、真空採取ボトルに接続し、プレートのウェルから培地を穏やかに吸引する。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、384ウェルプレート全体に作りたての4%パラホルムアルデヒドのウェルあたり20マイクロリットルを加え、室温で20分間細胞を固定します。固定後、プレートを通常の光にします。
そこでは、8チャンネル吸引器を使用して、パラホルムアルデヒドを各ウェルに吸引し、マルチチャンネルピペットを使用してPBSのウェルあたり50マイクロリットルを加える。吸引し、合計3回の洗浄サイクルのためにPBSを交換してください。次に、各ウェルに5%ヤギの血清のウェルあたり20マイクロリットルを加え、室温で30分間プレートをインキュベートします。
インキュベーションに続いて、ウェルを吸引し、1ミリリットルB630抗ロドプシン抗体あたり20マイクログラムの15マイクロリットルを加え、1%ヤギ血清中の行A〜O.Nextのウェルに1%ヤギ血清を加え、2次抗体のみの対照群の1%ヤギ血清のウェルに15マイクロリットルを加える。室温でプレートを90分間、または一晩で摂氏4度でインキュベートします。次に、フルオロフォアの光の吹き出しを避けるために、アルミニウム箔でプレートを覆います。
次に、PBSの井戸当たり50マイクロリットルでプレートを3回洗浄します。最後の洗浄に続いて、PBSを吸引し、Cy3-共役ヤギ抗マウスIgG抗体の1ミリリットル当たり5マイクログラムのウェルあたり15マイクロリットルを加える。プレートをアルミホイルで覆い、室温で1時間インキュベートします。
インキュベーションに続いて、プレートを3回洗います。次に、PBSのウェルあたり50マイクロリットルを加え、室温で1ミリリットル当たり1マイクログラムを15分間含有する。最後に、透明なフィルムでウェルプレートを密封し、アルミホイルで覆い、最大1週間摂氏4度で保管します。
ホイルを取り外し、サンプルプレートを高内容のイメージャーに配置し、A1をプレートの左上隅に配置します。次に、画像取得ソフトウェアを開いて、画像取得用のパラメータを設定します。プレート取得セットアップウィンドウを開き、新しい設定を作成するか、既存のセットアップファイルをロードします。
20X の目的を選択し、ピクセルビニングを 2 として設定し、キャリブレーション済みピクセル サイズは 0.80 x 0.80 ミクロンになるようにします。次に、スキャンラインを2000に設定し、画像サイズを1サイトあたり1000 x 1000ピクセルに設定します。次に、イメージするプレートタイプを選択します。
プレート寸法を記入するために、メーカーから提供された情報を使用します。さて、井戸ごとに画像化される4つのサイトと一緒に画像化される井戸を選択します。吸引のヒントに触れられる井戸の側面を避けてください。
イメージングでは、励起レーザーを405、488、461ナノメートルとして選択します。次に、DAPI、FITC、テキサスレッドチャンネルのエミッションフィルタを選択します。各チャンネルのレーザーパワーとゲインを最適化し、正のコントロールウェルが飽和していないことを確認します。
オートフォーカスのためによく焦点を合わせるのによく選択してください。次に、取得する最初の井戸を選択し、すべてのサイトのサイトのオートフォーカスを設定します。また、各チャネルに対して 1 行あたり 4 つの平均値を選択し、各チャネルの Z オフセット値を最適化します。
プレートの隅で2~3個の井戸を最初にテストし、すべてのテスト済みの井戸に焦点を当てるようにして、すべてが適切に設定されていることを検証します。次に、ウェルごとにすべてのサイトからの画像が40%以上の合流率を持つ細胞を持っていることを確認してください。最後に、すべてのチャネルの蛍光強度が100%制御ウェルで約半分飽和していることを確認する。
次に、画像取得方法を保存し、プレート全体を実行する。イメージャーを見て、イメージャーを離れる前に、プレートの最初の列からイメージのキャプチャを完了して、イメージの品質を再確認します。完成したら、プレートを取り外し、今後の使用のために摂氏4度で保管してください。
高コンテンツ画像解析ソフトウェアを使用して、画像データを取り出します。23 列目の 100% コントロール ウェルのいずれかを選択して、パラメーターを設定します。まず、解析方法としてマルチ波長セルのスコアリングを選択し、追加の設定を開始します。
DAPI チャネルのイメージを使用して、核を定義します。選択したウェルに定義された核形状が核画像に適合していることを確認するプレビュー。次に、FITC チャネルで、ロドプシン Venus が画像化されるセルの形状を定義します。
これを達成するために、各細胞の最小および最大直径、背景上の最小蛍光強度、ならびに各細胞の最小面積を設定する。さて、テキサスレッドチャネルのロドプシン細胞表面染色領域を定義し、細胞形状の最小および最大直径、背景上の蛍光強度の最小および各染色された細胞の最小面積を設定することによって。設定が最適化されているかどうかを判断するために、5つのウェルで現在のアルゴリズムをテストします。
次に、設定を保存し、構成ウィンドウを閉じます。最適化された分析方法ですべての井戸を実行します。完了したら、オブジェクト番号を無傷のセル番号としてエクスポートします。
FITCチャンネルの平均強度をロドプシン金星強度としてエクスポートし、テキサスレッドチャンネルの平均強度をセル表面のロドプシン強度としてエクスポートします。スプレッドシート ソフトウェアを使用して、各パラメータに対して 2 色のヒート マップを生成します。X 軸上にセルラインの名前を並べ、y 軸上にコンパウンドを配置します。
ここでは、P23Hロドプシン金星の画像はU2OS細胞を処理し、金星蛍光を緑色で発現し、細胞表面の免疫染色を赤色で表した。細胞は、DMSOまたは5個のミクロモル9-シス-レチナルで処理した。ロドプシン輸送アッセイは、種々の条件下で全細胞におけるロドプシン量を比較し、P23H変異細胞株において有意な回復を示し、9-シス-レチナルで処理した場合である。
また、細胞表面上のロドプシン強度は、細胞表面のロドプシン染色の比率と全細胞におけるロドプシン金星強度に対する比と、P23H変異体に対して有意に低くはないが、DMSOで処理された野生型ロドプシンと比較する。ヒート マップは、複数の変異体のセルあたりの平均ロドプシン量とローカリゼーションを比較する効率的な方法です。ここで、野生型対照および6個のロドプシン変異体が水平に列挙され、化合物処理の効果を垂直に比較する。
これまでの研究と一致して、細胞表面のロドプシン強度と細胞表面のロドプシン染色の比率と、セル表面のロドプシンの強度と、DMSOで処理された野生型と比較して6つの変異体の強度が低い。化合物1、2、6および9は、T4R、P23H、D190N、およびP267Lロドプシン変異体におけるロドプシン金星強度に対する細胞表面上のロドプシン染色の比率を有意に増加させ、これらの化合物がこれらのロドプシン変異体の細胞膜への輸送を救うことを示唆している。これは画像分析にとって重要であるため、固定前に細胞は50〜70%のコンフルエントである必要があります。
また、プレート全体に井戸の画像を見せました。フォーカスのある画像と、終了しない蛍光がどのチャンネルのしきい値もすべて持っていることを確認します。選択化合物まで、誤って折り畳まれたロドプシン輸送を救助し、プロセスを検証し、次にロドプシンP23H突然変異体を発現するマウスモデルを使用して、生体内でこれらの化合物の有効性を渡すことができる。
この方法により、膜タンパク質量とその局在性を定量化することができます。したがって、それは、保存および分解を支援する膜タンパク質で開始したマイクロミスのための素晴らしいツールです。パラホルムアルデヒドは、この実験と同様に、この試薬の取り扱いに関する手順を有する。
それはフードの下で行われます。この試薬を含む廃棄物は、有害な化学物質として適切に廃棄する必要があります。
