ヒト尿由来細胞をミオチューブに直接リプログラミングするための新しいプロトコルを確立しました。このインビトロモデリングは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来の筋管におけるエキソンスキップを評価することを可能にする。3-デアザネプラノシンA塩酸塩DZnepはヒストンメチルトランスファーゼ阻害剤であり、短時間でUDCをミオチューブに直接スクリーニングすることを有意に促進できることを発見した。
この新しい自家的なUDCベースの疾患モデリングは、様々な筋肉疾患の応用精密医療につながる可能性があります。まず、尿サンプル全体を室温で10分間400xgで遠心する。次に、上清をチューブに1ミリリットル残して吸引する。
残りの1ミリリットルの尿中にペレットを個別に再懸濁する。1本の50ミリリットルチューブにまとめて、10ミリリットルの洗浄バッファーをチューブに加えます。試料を室温で10分間200xgで遠心分離する。
上清を吸引し、チューブに0.2ミリリットルを残します。細胞ペレットを一次培地の4.5ミリリットルに再懸濁する。ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートの3つの井戸、ウェルあたり1.5ミリリットルの細胞懸濁液に細胞を播種します。
摂氏37度と5%の二酸化炭素で培養。3日間、毎日1.5ミリリットルのプライマリ培地を加えます。4日目に、原稿に記載されているように補充された1.5ミリリットルの成長培地で培地を交換する。
4日目以降、UDC培養が80〜90%コンフルエントになるまで、1日おきに補充された成長培地を交換してください。その後、培地を取り出し、PBSで細胞を洗います。0.25%トリプシン-EDTAを使用してセルを分割します。
新しいゼラチンコーティングされた60ミリメートル皿に平方センチメートルあたり3,000〜5,000細胞の密度で細胞を播種します。UDCをゼラチンコーティングされた60ミリメートル皿に1平方センチメートルあたり3,000〜5,000個の細胞に播種し、インキュベーターに皿を入れます。播種後24時間後、解凍されたレトロウイルスを200の多重度で細胞に感染させる。
1ミリリットル当たり8マイクログラムのヘキサジメトリン臭化物濃度で新鮮な培地を使用してください。摂氏37度と5%の二酸化炭素で24時間インキュベートします。MYOD1形質導入細胞を選択するには、培養培地を、ピューロマイシン1ミリリットル当たり1マイクログラムを含む新鮮な増殖培地に置き換える。
7 日から 10 日間、1 日おきにメディアを変更します。MYOD1を導入したUDCをコラーゲンコーティングされたマルチウェルプレートに入れなさい。細胞を24時間インキュベートした後、原稿に記載の分化培地に成長培地を変更する。
次いで3日後、DZNepを使用せずに新しい分化培地に分化培地を変更する。3 日ごとにメディアの変更を続けます。アンチセンスオリゴヌクレオチドをMYOD1トランスデューセのUDCにトランスフェクトするには、ASOトランスフェクション試薬と分化培地を1~10マイクロモルの最終濃度に混合します。
そして、ウェル内の媒体を交換するために、この混合物を使用してください。37°Cと湿度5%でプレートをインキュベートします。ASOで72時間培養した後、ASOを使用せずに培地を新鮮な分化培地に変更する。
ASOトランスフェクションの3~7日後、分化培地を除去する。PBSでUDCを1回洗い、細胞溶菌バッファーを追加します。RNA抽出キットを使用して、トータルRNAを収穫します。
分光光度計でRNA濃度を測定します。原稿に記載されているように、PCRチューブにワンステップRT-PCR用試薬を組み合わせます。PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、サーモサイクラーを実行します。
マイクロチップ電気泳動を行い、エキソンスキップ効率を計算します。UDCは、一次培養の1週間以内に容易かつ非侵襲的に収集され、コロニーを形成した。DZNepとの分化培地中のMYOD1トランスフェクションUDCは、互いに融合し、効率的に多核化ミオチューブを形成することができた。
RT-PCRは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者由来のMYOD1-UDCにおけるエクソンスキップを明確に検出した。スキップ効率は、ASOの投与量に依存していた。用量依存性エキソンスキップもウェスタンブロットによって検出された。
ジストロフィンの強度は、ASOトランスフェクションの1週間後に蛍光顕微鏡で測定した。対照よりもASOで処理されたMYOD1-UDCでは、著しく高い蛍光シグナルが観察された。これらの疾患の病態生理学の理解につながるあらゆる筋肉疾患をモデル化することができます。
