Hemos establecido un nuevo protocolo para la reprogramación directa de células derivadas de orina humana en miotubos. Este modelado in vitro nos permite evaluar la falta de exón en los miotubos derivados del paciente con distrofia muscular de Duchenne. Descubrimos que el clorhidrato de 3-deazaneplanocina A, DZnep, es inhibidor de la histona metiltransferasa podría promover significativamente el cribado directo de las UDC en miotu en un corto período de tiempo.
Este nuevo modelado autólogo de la enfermedad basada en UDC podría conducir a la aplicación de medicina de precisión para diversas enfermedades musculares. Para comenzar, centrifuga toda la muestra de orina a 400 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, aspirar el sobrenadante dejando un mililitro en el tubo.
Resuspender los gránulos individualmente en el mililitro de orina restante. Recogerlos en un solo tubo de 50 mililitros y añadir 10 mililitros de tampón de lavado al tubo. Centrifugar las muestras a 200 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Aspirar el sobrenadante dejando 0,2 mililitros en el tubo. Resuspender los gránulos celulares en 4,5 mililitros de medio primario. Siembra las células en tres pozos de placa de seis pozos recubierta de gelatina, 1,5 mililitros de suspensión celular por pozo.
Cultivo a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono. Durante tres días añadir 1,5 mililitros del medio primario cada día. En el cuarto día, reemplace el medio con 1,5 mililitros de medio de crecimiento complementados como se describe en el manuscrito.
Después del cuarto día, reemplace el medio de crecimiento suplementado cada dos días hasta que la cultura UDC sea de 80 a 90%confluente. Luego retire el medio y lave las células con PBS. Divida las células usando 0.25%trypsin-EDTA.
Siembra las células a una densidad de 3.000 a 5.000 células por centímetro cuadrado sobre un nuevo plato recubierto de gelatina de 60 milímetros. Siembra los UDC a 3.000 a 5.000 células por centímetro cuadrado en un plato de 60 milímetros recubierto de gelatina y coloca el plato en la incubadora. 24 horas después de la siembra, infectar las células con retrovirus descongelados a una multiplicidad de infección de 200.
Utilice un medio fresco con una concentración de bromuro de hexadimetrina de 8 microgramos por mililitro. Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Para seleccionar las células transducidas por MYOD1, sustituya el medio de cultivo por un medio de crecimiento fresco que contenga un microgramo por mililitro de puromicina.
Continúe cambiando el medio cada dos días durante siete a 10 días. Placa de los UDC transducidos por MYOD1 en una placa multi-pozo recubierto de colágeno. Después de incubar las células durante 24 horas, cambie el medio de crecimiento al medio de diferenciación descrito en el manuscrito.
Después de tres días, cambie el medio de diferenciación a medio de diferenciación fresco sin DZNep. Continúe cambiando el medio cada tres días. Para transfecar el oligonucleótido antisrés en los UDC transducidos por MYOD1, mezcle el reactivo de transfección ASO y el medio de diferenciación a una concentración final de uno a 10 micromolares.
Y utilice esta mezcla para reemplazar el medio en los pozos. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de humedad. Después de 72 horas de incubación con ASO, cambie el medio de diferenciación medio a nuevo sin ASO.
De tres a siete días después de la transfección de ASO, retire el medio de diferenciación. Lave los UDC una vez con PBS y agregue el búfer de lelisis de celda. Cosecha el ARN total utilizando un kit de extracción de ARN.
Mida la concentración de ARN con un espectrofotómetro. Como se describe en el manuscrito, combine los reactivos para RT-PCR de un solo paso en tubos PCR. Coloque los tubos PCR en el termociclador y ejecute el termociclador.
Realice la electroforesis de microchip y calcule la eficiencia de salto de exón. Las UDC se recogieron de forma fácil y no invasiva y formaron colonias dentro de una semana de cultura primaria. Los UPC trans infectados MYOD1 en medio de diferenciación con DZNep podrían fusionarse entre sí y formar miotubos multinucleados de manera eficiente.
RT-PCR detectó claramente saltos de exón en MYOD1-UDCs derivados de pacientes con distrofia muscular de Duchenne. Saltar la eficiencia dependía de la dosis de ASO. La omisión de exón dependiente de la dosis también fue detectada por Western blot.
Las intensidades de la distrofina se midieron con microscopio fluorescente una semana después de la transfección aso. Se observaron señales fluorescentes notablemente más altas en MYOD1-UDC tratados con ASO que en el control. Podemos modelar cualquier enfermedad muscular que conduzca a la comprensión de la fisiopatología de esas enfermedades.
