Мы установили новый протокол для прямого перепрограммирования клеток человека, полученных из мочи, в миотрубы. Это моделирование in vitro позволяет нам оценить exon пропуская в myotubes выведенных от пациента с мышечной дистрофией Duchenne. Мы обнаружили, что 3-deazaneplanocin гидрохлорид, D'nep, являются ингибитором метилтрансферазы гистона может значительно способствовать прямому скринингу UDCs в миоту в короткий промежуток времени.
Это новое аутологичное моделирование болезней на основе УДК может привести к применению точной медицины для различных мышечных заболеваний. Для начала центрифуга всей мочи составляет 400 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее, аспирировать супернатант оставив один миллилитр в трубке.
Resuspend гранулы индивидуально в оставшемся один миллилитр мочи. Соберите их в одну 50 миллилитровую трубку и добавьте 10 миллилитров стирального буфера в трубку. Центрифуга образцов при температуре 200 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Аспирировать супернатант оставляя 0,2 миллилитров в трубке. Повторное производство клеточных гранул в 4,5 миллилитров первичной среды. Семя клетки в трех колодцах желатина покрытием шесть скважин пластины, 1,5 миллилитров клеточной суспензии на скважину.
Культура при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. В течение трех дней добавляйте 1,5 миллилитров первичной среды каждый день. На четвертый день замените носитель 1,5 миллилитров среды роста, дополненных, как описано в рукописи.
После дня четыре, заменить дополненную среду роста через день, пока культура УДК от 80 до 90% стечения. Затем удалите среду и промыть клетки с PBS. Разделите ячейки, используя 0.25%трипсин-EDTA.
Семя клеток при плотности от 3000 до 5000 клеток на квадратный сантиметр на новый желатин покрытием 60 миллиметров блюдо. Семя UDCs на 3000 до 5000 клеток на квадратный сантиметр на желатин покрытием 60 миллиметров блюдо и поместите блюдо в инкубатор. Через 24 часа после посева, заразить клетки с разморожевания ретровируса на множественность инфекции 200.
Используйте свежую среду с концентрацией бромистого гексадиметрина 8 микрограмм на миллилитр. Инкубировать в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. Чтобы выбрать клетки, индуцированные MYOD1, замените культурную среду свежей средой роста, содержащей один микрограмм на миллилитр пуромицина.
Продолжайте менять носитель через день в течение семи-10 дней. Плита MYOD1-трансдуцированных UDCs в коллагена покрытием несколько хорошо пластины. После инкубации клеток в течение 24 часов измените средний рост на среду дифференциации, описанную в рукописи.
Затем, через три дня, измените среду дифференциации на свежую дифференциацию среды без ДЗНЕП. Продолжайте менять носитель каждые три дня. Чтобы трансфицируют антисенсовый олигонуклеотид в MYOD1-трансдуцированные UDCs, смешайте реагент аСО трансинфекции и дифференциацию среды до конечной концентрации от одного до 10 микромолеров.
И использовать эту смесь для замены среды в скважинах. Инкубировать пластину при 37 градусах По Цельсию и 5%влажности. После 72 часов инкубации с ASO, изменить средний на свежий дифференциации среды без ASO.
Через три-семь дней после трансфекции ASO удалите дифференциацию среды. Вымойте UDCs один раз с PBS и добавить буфер лиза ячейки. Урожай общей РНК с помощью комплекта извлечения РНК.
Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра. Как описано в рукописи, объединить реагенты для одношагового RT-PCR в ПЦР труб. Поместите трубки ПЦР в термоциклер и запустите термоциклер.
Выполните электрофорез микрочипа и вычислите эффективность пропуска экзона. UDCs были собраны легко и неинвазивно и сформированные колонии в пределах недели главным образом культуры. MYOD1 трансфицированных UDCs в дифференциации среды с D'Nep может сливаться друг с другом и формируется многоядерных миотрубов эффективно.
RT-PCR четко обнаружены эксон пропуск в MYOD1-UDCs, полученных от пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна. Эффективность пропуска зависит от дозы АСО. Доза-зависимых экзон пропуск был также обнаружен западной пятно.
Интенсивности дистрофина были измерены с помощью флуоресцентного микроскопа через неделю после трансфекции ASO. Заметно более высокие флуоресцентные сигналы наблюдались в MYOD1-UDCs, обработанных ASO, чем в контроле. Мы можем смоделировать любое мышечное заболевание, ведущее к пониманию патофизиологии этих заболеваний.
