הקמנו פרוטוקול חדש לתכנות מחדש ישיר של תאים אנושיים שמקורם בשתן לתוך מיוטובים. זה מודלים במבחנה מאפשר לנו להעריך דילוג exon ב myotubes נגזר המטופל עם ניוון שרירים דושן. גילינו כי 3-deazaneplanocin הידרוכלוריד, DZnep, הם מעכבי מתילרנספראז היסטון יכול לקדם באופן משמעותי הקרנה ישירה של UDCs לתוך myotube בתוך זמן קצר.
זה חדש אוטולוגי UDC מבוססי מידול המחלה יכול להוביל את התרופה דיוק היישום עבור מחלות שרירים שונות. כדי להתחיל, צנטריפוגה מדגם השתן כולו ב 400 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי והשאיר מיליליטר אחד בצינור.
תן את הכדורים בנפרד במיליליטר הנותר של שתן. לאסוף אותם בצינור אחד 50 מיליליטר ולהוסיף 10 מיליליטר של חיץ כביסה לצינור. צנטריפוגה הדגימות ב 200 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
שאף את העל-טבעי והשאיר 0.2 מיליליטר בצינור. תן שימוש חוזר לכדורי התא ב-4.5 מיליליטר של המדיום הראשי. זרע את התאים בשלוש בארות של צלחת שש באר מצופה ג'לטין, 1.5 מיליליטר של השעיית תאים ל הבאר.
תרבות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. במשך שלושה ימים להוסיף 1.5 מיליליטר של המדיום העיקרי בכל יום. ביום הרביעי, החלף את המדיום עם 1.5 מיליליטר של מדיום צמיחה בתוספת כמתואר בכתב היד.
לאחר היום הרביעי, החלף את מדיום הצמיחה המוסף כל יומיים עד שתרבות ה- UDC היא 80 עד 90%. לאחר מכן להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם PBS. פצל את התאים באמצעות 0.25%trypsin-EDTA.
זרע את התאים בצפיפות של 3, 000 עד 5, 000 תאים לסנטימטר בריבוע על צלחת חדשה מצופה ג'לטין 60 מילימטר. זרעים UDCs ב 3, 000 כדי 5, 000 תאים לסנטימטר מרובע על צלחת מצופה ג'לטין 60 מילימטר ולהמקם את המנה באינקובטור. 24 שעות לאחר הזריעה, להדביק את התאים עם רטרווירוס מופשר בריבוי של זיהום של 200.
השתמש בינוני טרי עם ריכוז ברומיד hexadimethrine של 8 מיקרוגרם למיליליטר. דגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. כדי לבחור את התאים המתומרים MYOD1, החלף את מדיום התרבות במדיום צמיחה טרי המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר של puromycin.
המשך לשנות את המדיום כל יומיים במשך שבעה עד עשרה ימים. צלחת MYOD1-מתמר UDCs בצלחת מצופה קולגן רב באר. לאחר הדגירה של התאים במשך 24 שעות, לשנות את מדיום הצמיחה למדיום ההתברמות המתואר בכתב היד.
לאחר שלושה ימים, לשנות את מדיום הבידול למדיום הבידול טרי ללא DZNep. המשך לשנות את המדיום כל שלושה ימים. כדי לשנות את אוליגונוקלאוטיד antisense לתוך UDCs מתמר MYOD1, לערבב ריאגנט transfection ASO ובינוני התברות לריכוז סופי של אחד עד 10 micromolar.
ולהשתמש בתערובת זו כדי להחליף את המדיום בארות. הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% לחות. לאחר 72 שעות דגירה עם ASO, לשנות את מדיום ההידול בינוני טרי ללא ASO.
שלושה עד שבעה ימים לאחר ביצוע חילוף ASO, הסר את מדיום ההבידול. שטפו את ה- UDCs פעם אחת באמצעות PBS והוסיפו מאגר תעודות תאים. לקצור את RNA הכולל באמצעות ערכת מיצוי RNA.
למדוד את ריכוז RNA עם ספקטרופוטומטר. כפי שמתואר בכתב היד, לשלב את reagents עבור צעד אחד RT-PCR בצינורות PCR. מקם את צינורות PCR בתרמוציקלר והפעל את התרמוצ'ילר.
בצע אלקטרופורזה שבב ולחשב את יעילות דילוג exon. UDCs נאספו בקלות ובלתי פולשנית ויצרו מושבות בתוך שבוע מהתרבות העיקרית. MYOD1 UDCs מגולפים במדיום הבידול עם DZNep יכול להתיך זה לזה ויצר מיוטובים רב-גרעיניים ביעילות.
RT-PCR זיהה בבירור דילוג אקסון ב MYOD1-UDCs נגזר מחולים עם ניוון שרירים דושן. דילוג על יעילות היה תלוי במינון של ASO. דילוג אקסון תלוי מינון זוהה גם על ידי כתם מערבי.
עוצמות של דיסטרופין נמדדו במיקרוסקופ פלואורסצנטי שבוע לאחר ההשתנות של ASO. אותות פלואורסצנטיים גבוהים משמעותית נצפו ב- MYOD1-UDCs שטופלו ב- ASO מאשר בפקד. אנחנו יכולים מודל כל מחלה שרירית המובילה להבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות אלה.
