Estabelecemos um novo protocolo para a reprogramação direta de células humanas derivadas da urina em miotubes. Esta modelagem in vitro nos permite avaliar o exon pulando nos môbos derivados do paciente com distrofia muscular de Duchenne. Descobrimos que 3-deazaneplanocina Um cloridrato, DZnep, é inibidor de histona metiltransferase poderia promover significativamente a triagem direta de UDCs no miotube em um curto espaço de tempo.
Esta nova modelagem autóloga baseada em doenças baseadas em UDC poderia levar à aplicação de medicina de precisão para várias doenças musculares. Para começar, centrifufique toda a amostra de urina a 400 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aspire o supernatante deixando um mililitro no tubo.
Resuspend as pelotas individualmente no restante um mililitro de urina. Colete-os em um único tubo de 50 mililitros e adicione 10 mililitros de tampão de lavagem ao tubo. Centrifugar as amostras a 200 x g por 10 minutos em temperatura ambiente.
Aspire o supernasal deixando 0,2 mililitros no tubo. Resuspense as pelotas de célula em 4,5 mililitros de meio primário. Semente as células em três poços de placa de seis poços revestidos de gelatina, 1,5 mililitros de suspensão celular por poço.
Cultura a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. Durante três dias adicione 1,5 mililitros do meio primário a cada dia. No quarto dia, substitua o meio por 1,5 mililitros de meio de crescimento suplementado conforme descrito no manuscrito.
Após o quarto dia, substitua o meio de crescimento suplementado a cada dois dias até que a cultura UDC seja 80 a 90% confluente. Em seguida, remova o meio e lave as células com PBS. Divida as células usando 0,25% de trippsina-EDTA.
Semear as células a uma densidade de 3.000 a 5.000 células por centímetro quadrado em um novo prato revestido de gelatina de 60 milímetros. Semente os UDCs a 3.000 a 5.000 células por centímetro quadrado em um prato revestido de gelatina 60 milímetros e coloque o prato na incubadora. 24 horas após a semeadura, infecte as células com retrovírus descongelado em uma multiplicidade de infecção de 200.
Use meio fresco com uma concentração de brometo de hexadimetrina de 8 microgramas por mililitro. Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para selecionar as células transduzidas pelo MYOD1, substitua o meio de cultura por um meio de crescimento fresco contendo um micrograma por mililitro de puromicina.
Continue a mudar o meio a cada dois dias por sete a dez dias. Emplaque os UDCs miod1 transduzidos em uma placa de colágeno revestida de vários poços. Após incubar as células por 24 horas, mude o meio de crescimento para o meio de diferenciação descrito no manuscrito.
Em seguida, depois de três dias, mude o meio de diferenciação de diferenciação para o meio de diferenciação fresco sem DZNep. Continue mudando o meio a cada três dias. Para transfetar o oligonucleotídeo antissamerado nos UDCs transduzidos pelo MYOD1, misture reagente de transfecção ASO e meio de diferenciação até uma concentração final de um a 10 micromolar.
E use esta mistura para substituir o meio nos poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de umidade. Após 72 horas de incubação com ASO, mude o meio de diferenciação médio para fresco sem ASO.
Três a sete dias após a transfecção do ASO, remova o meio de diferenciação. Lave os UDCs uma vez com PBS e adicione o tampão de lise celular. Colher o RNA total usando um kit de extração de RNA.
Meça a concentração de RNA com um espectotômetro. Como descrito no manuscrito, combine os reagentes para um passo RT-PCR em tubos PCR. Coloque os tubos PCR no termociclador e execute o termociclador.
Realize a eletroforese do microchip e calcule a eficiência de pular o exon. Os UDCs foram coletados facilmente e não invasivamente e formaram colônias dentro de uma semana de cultura primária. Os UDCs transfectados MYOD1 em meio de diferenciação com DZNep poderiam se fundir uns aos outros e formaram miotubes multinucleados de forma eficiente.
RT-PCR detectou claramente exon pulando em MYOD1-UDCs derivados de pacientes com distrofia muscular de Duchenne. Pular a eficiência dependia da dose de ASO. O salto de exon dependente de dose também foi detectado pela mancha ocidental.
As intensidades da distrofina foram medidas com microscópio fluorescente uma semana após a transfecção do ASO. Sinais fluorescentes notavelmente mais elevados foram observados em MYOD1-UDCs tratados com ASO do que no controle. Podemos modelar qualquer doença muscular que leve à compreensão da fisiopatologia dessas doenças.
