우리는 인간 소변 유래 세포를 myotubes로 직접 재프로그래밍하기위한 새로운 프로토콜을 설립했습니다. 이 체외 모델링을 통해 Duchenne 근 이영양증 환자에서 파생된 근사 튜브에서 엑슨 건너뛰기를 평가할 수 있습니다. 우리는 3-deazaneplanocin A 염산염, DZnep, 히스톤 메틸 트랜스퍼라제 억제제는 크게 시간의 짧은 시간에 myotube로 UDC의 직접 검사를 촉진 할 수 있음을 발견했다.
이 새로운 자가 UDC 기반 질병 모델링은 다양한 근육 질환에 대한 응용 정밀 의학으로 이어질 수 있습니다. 시작하려면 전체 소변 샘플을 실온에서 10 분 동안 400 x g로 원심 분리합니다. 다음으로, 튜브에 1 밀리리터를 남기는 슈퍼네티터를 흡인시합니다.
소변의 나머지 1 밀리 리터에서 개별적으로 펠 릿을 다시 중단. 50밀리리터 튜브 를 한 개 모아 튜브에 10 밀리리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 200 x g의 샘플을 원심 분리합니다.
튜브에 0.2 밀리리터를 남기는 슈퍼네티드를 흡인합니다. 1 차적인 매체의 4.5 밀리리터에서 세포 펠릿을 재중단합니다. 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트의 세 우물에서 세포를 시드, 잘 당 세포 현탁액의 1.5 밀리리터.
섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 문화. 3일 동안 매일 1.5밀리리터를 추가합니다. 4일째에, 원고에 설명된 대로 보충된 성장 매체의 1.5 밀리리터로 배지를 대체한다.
4일 후, UDC 문화가 80~90%의 컨실루물이 될 때까지 매일 보충 성장 매체를 교체하십시오. 그런 다음 매체를 제거하고 PBS로 세포를 씻으시다. 0.25%의 트립신-EDTA를 사용하여 셀을 분할합니다.
세포를 3, 000 에서 5, 제곱 센티미터당 000 세포의 밀도로 새로운 젤라틴 코팅 60 mm 접시에 시드합니다. 젤라틴 코팅 60mm 접시에 3, 000 ~ 5, 000 셀당 UDCs를 시드하고 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 파종 후 24 시간, 200의 감염의 복합성에서 해동 된 레트로 바이러스로 세포를 감염.
밀리리터당 8마이크로그램의 헥사디메린 브로마이드 농도를 가진 신선한 배지를 사용하십시오. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양하세요. MYOD1 변환 된 세포를 선택하려면 배양 배지를 puromycin의 밀리리터 당 1 마이크로 그램을 포함하는 신선한 성장 배지로 대체하십시오.
7일에서 10일 동안 격일로 배지를 계속 변경합니다. 콜라겐 코팅 멀티 웰 플레이트에 MYOD1 변환 UDCs를 플레이트. 24시간 동안 세포를 배양한 후, 원고에 기재된 분화 매체로 성장 배지를 변경한다.
그런 다음 3 일 후, DZNep없이 신선한 분화 매체로 분화 매체를 변경합니다. 3일마다 배지를 계속 변경합니다. 항감각 올리고뉴클레오티드를 MYOD1-트랜스포밍 UDC로 전환하려면 ASO 이식 시약 및 분화 배지를 1-10 마이크로몰라의 최종 농도로 혼합한다.
그리고 우물에서 배지를 대체하기 위해이 혼합물을 사용합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 습도 5%로 배양합니다. ASO로 72시간 배양 후, ASO 없이 배지를 신선한 분화 매체로 변경합니다.
ASO 이식 후 3~7일 후에 분화 매체를 제거한다. PBS로 UDC를 한 번 세척하고 셀 리시스 버퍼를 추가합니다. RNA 추출 키트를 사용하여 총 RNA를 수확하십시오.
분광계로 RNA 농도를 측정합니다. 원고에 설명된 바와 같이 PCR 튜브에서 1단계 RT-PCR시약을 결합합니다. PCR 튜브를 열순환기에 놓고 써모사이클러를 실행합니다.
마이크로칩 전기전도를 수행하고 엑슨 건너뛰기 효율을 계산합니다. UDC는 1차 문화의 1주일 이내에 쉽고 비침습적으로 수집되었으며 식민지를 형성했다. MYOD1 DZNep와 분화 매체에서 UDCs를 트랜스페드하면 서로 융합될 수 있고 다핵된 근사튜브를 효율적으로 형성할 수 있다.
RT-PCR은 Duchenne 근 위축증 환자에서 파생된 MYOD1-UDCs에서 엑슨 건너뛰기를 명확하게 검출했습니다. 효율성을 건너뛰는 것은 ASO의 투여량에 의존하였다. 투여량 의존식 엑슨 건너뛰기도 서양 얼룩에 의해 검출되었다.
Dystrophin의 텐스는 ASO 경질 후 1 주일 형광 현미경으로 측정되었습니다. 눈에 띄게 높은 형광 신호는 대조군보다 ASO로 처리된 MYOD1-UDCs에서 관찰되었다. 우리는 그 질병의 병리생리학의 이해로 이끌어 내는 어떤 근육 병든지 모델링할 수 있습니다.
