Abbiamo stabilito un nuovo protocollo per la riprogrammazione diretta delle cellule derivate dalle urine umane in miotubi. Questa modellazione in vitro ci consente di valutare l'esone saltando nei miotubi derivati dal paziente con distrofia muscolare di Duchenne. Abbiamo scoperto che 3-deazaneplanocina Un cloridrato, DZnep, sono inibitori dell'istone metiltransferasi potrebbero promuovere significativamente lo screening diretto degli UDC in miotubo in breve tempo.
Questa nuova modellazione autologa della malattia basata sull'UDC potrebbe portare alla medicina di precisione applicativa per varie malattie muscolari. Per iniziare, centrifugare l'intero campione di urina a 400 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aspirare il supernatante lasciando un millilitro nel tubo.
Rimosogliere i pellet singolarmente nel restante millilitro di urina. Raccogliere quelli in un singolo tubo da 50 millilitri e aggiungere 10 millilitri di tampone di lavaggio al tubo. Centrifugare i campioni a 200 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
Aspirare il supernatante lasciando 0,2 millilitri nel tubo. Resuspend il pellet cellulare in 4,5 millilitri di mezzo primario. Seminare le cellule in tre pozzali di piastra a sei pozzi rivestita di gelatina, 1,5 millilitri di sospensione cellulare per pozzo.
Coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per tre giorni aggiungere 1,5 millilitri del mezzo primario ogni giorno. Il quarto giorno, sostituire il mezzo con 1,5 millilitri di mezzo di crescita integrati come descritto nel manoscritto.
Dopo il quarto giorno, sostituisci il mezzo di crescita integrato a giorni dall'altro fino a quando la cultura UDC non è confluente dall'80 al 90%. Quindi rimuovere il mezzo e lavare le celle con PBS. Dividere le celle utilizzando lo 0,25% di tripside-EDTA.
Semina le cellule a una densità da 3.000 a 5.000 cellule per centimetro quadrato su un nuovo piatto di 60 millimetri rivestito di gelatina. Seminare gli UDC a 3.000-5.000 cellule per centimetro quadrato su un piatto da 60 millimetri rivestito di gelatina e posizionare il piatto nell'incubatrice. 24 ore dopo la semina, infettare le cellule con retrovirus scongelato a una molteplicità di infezione di 200.
Utilizzare un mezzo fresco con una concentrazione di bromuro di esadimetamina di 8 microgrammi per millilitro. Incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per selezionare le cellule trasdotta MYOD1, sostituire il mezzo di coltura con un mezzo di crescita fresco contenente un microgrammo per millilitro di puromicina.
Continuare a cambiare il mezzo a giorni diversi per sette o 10 giorni. Placcare gli UDC trasdotti MYOD1 in una piastra multi-pozzo rivestita di collagene. Dopo aver incubato le cellule per 24 ore, cambiare il mezzo di crescita in mezzo di differenziazione descritto nel manoscritto.
Quindi, dopo tre giorni, cambiare il mezzo di differenziazione in mezzo di differenziazione fresco senza DZNep. Continuare a cambiare il mezzo ogni tre giorni. Per trasfetto l'oligonucleotide antisenso negli UDC trasdotti da MYOD1, mescolare il reagente di trasfezione ASO e il mezzo di differenziazione fino a una concentrazione finale da uno a 10 micromolare.
E usa questa miscela per sostituire il mezzo nei pozzi. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di umidità. Dopo 72 ore di incubazione con ASO, cambiare il mezzo di differenziazione medio-fresco senza ASO.
Da tre a sette giorni dopo la trasfezione ASO, rimuovere il mezzo di differenziazione. Lavare gli FDC una volta con PBS e aggiungere il buffer di lysis cellulare. Raccogliere l'RNA totale utilizzando un kit di estrazione dell'RNA.
Misurare la concentrazione di RNA con uno spettrofotometro. Come descritto nel manoscritto, combinare i reagenti per RT-PCR in un solo passaggio in tubi PCR. Posizionare i tubi PCR nel termociclo e eseguire il termociclo.
Eseguire l'elettroforesi dei microchip e calcolare l'efficienza di salto dell'esone. Gli UDC sono stati raccolti facilmente e in modo non invasivo e hanno formato colonie entro una settimana dalla cultura primaria. Gli UDC trasfettati MYOD1 in mezzo di differenziazione con DZNep potrebbero fondersi tra loro e formare miotubi multinucleati in modo efficiente.
RT-PCR ha chiaramente rilevato il salto dell'esone nei MYOD1-UDC derivati da pazienti con distrofia muscolare di Duchenne. Saltare l'efficienza dipendeva dalla dose di ASO. Il salto dell'esone dipendente dalla dose è stato rilevato anche dalla macchia occidentale.
Intensità di distrofina sono state misurate con microscopio fluorescente una settimana dopo la trasfezione ASO. Segnali fluorescenti marcatamente più elevati sono stati osservati nei MYOD1-UDC trattati con ASO che nel controllo. Possiamo modellare qualsiasi malattia muscolare che porti alla comprensione della fisiopatologia di queste malattie.
