Wir haben ein neues Protokoll zur direkten Umprogrammierung menschlicher Urinzellen in Myotuben erstellt. Diese In-vitro-Modellierung ermöglicht es uns, Exon-Skipping in den Myotuben von Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie abgeleitet zu bewerten. Wir entdeckten, dass 3-Deazaneplanocin A Hydrochlorid, DZnep, Histon-Methyltransferase-Inhibitor enden könnte signifikant das direkte Screening von UDCs in Myotube in kurzer Zeit fördern.
Diese neue autologe UDC-basierte Krankheitsmodellierung könnte zur Anwendungspräzisionsmedizin für verschiedene Muskelerkrankungen führen. Zunächst zentrieren Sie die gesamte Urinprobe bei 400 x g 10 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes aspirieren Sie den Überstand und lassen Sie einen Milliliter in der Röhre.
Die Pellets einzeln in den restlichen einem Milliliter Urin aussetzen. Sammeln Sie diese in einem einzigen 50 Milliliter Rohr und fügen Sie 10 Milliliter Waschpuffer in die Röhre. Zentrifugieren Sie die Proben bei 200 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Aspirieren Sie den Überstand und lassen Sie 0,2 Milliliter in der Röhre. Setzen Sie die Zellpellets in 4,5 Milliliter Primärmedium aus. Säen Sie die Zellen in drei Brunnen von Gelatine-beschichteten Sechs-Brunnen-Platte, 1,5 Milliliter Zellsuspension pro Brunnen.
Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Für drei Tage fügen Sie 1,5 Milliliter des primären Mediums pro Tag hinzu. Ersetzen Sie am vierten Tag das Medium durch 1,5 Milliliter Wachstumsmedium, ergänzt wie im Manuskript beschrieben.
Nach Tag vier, ersetzen Sie das ergänzte Wachstumsmedium jeden zweiten Tag, bis die UDC-Kultur 80 bis 90% konfluent ist. Entfernen Sie dann das Medium und waschen Sie die Zellen mit PBS. Teilen Sie die Zellen mit 0,25%trypsin-EDTA.
Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 3.000 bis 5 000 Zellen pro Quadratzentimeter auf eine neue gelatinebeschichtete 60-Millimeter-Schale. Säen Sie die UDCs bei 3.000 bis 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf einer gelatinebeschichteten 60-Millimeter-Schale und legen Sie die Schale in den Inkubator. 24 Stunden nach der Aussaat, infizieren sie die Zellen mit aufgetauten Retrovirus bei einer Vielzahl von Infektionen von 200.
Verwenden Sie frisches Medium mit einer Hexadimethrinbromidkonzentration von 8 Mikrogramm pro Milliliter. 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Um die MYOD1-transduzierten Zellen auszuwählen, ersetzen Sie das Kulturmedium durch ein frisches Wachstumsmedium, das ein Mikrogramm pro Milliliter Puromycin enthält.
Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für sieben bis zehn Tage. Die MYOD1-transduzierten UDCs in einer kollagenbeschichteten Multi-Well-Platte. Nach der Inkubation der Zellen für 24 Stunden, ändern Sie das Wachstumsmedium zu Differenzierungsmedium im Manuskript beschrieben.
Dann nach drei Tagen, ändern Sie das Differenzierungsmedium auf frischeDifferenzierungsmedium ohne DZNep. Wechseln Sie das Medium alle drei Tage weiter. Um das Antisense-Oligonukleotid in die MYOD1-transduced UDCs zu transfectieren, mischen Sie ASO-Transfektionsreagenz und Differenzierungsmedium zu einer Endkonzentration von eins bis 10 Mikromolaren.
Und verwenden Sie diese Mischung, um das Medium in den Brunnen zu ersetzen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Luftfeuchtigkeit. Nach 72 Stunden Inkubation mit ASO, ändern Sie das Medium zu frischem Differenzierungsmedium ohne ASO.
Drei bis sieben Tage nach der ASO-Transfektion entfernen Sie das Differenzierungsmedium. Waschen Sie die UDCs einmal mit PBS und fügen Sie den Zelllysepuffer hinzu. Ernte der gesamten RNA mit einem RNA-Extraktionskit.
Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer. Wie im Manuskript beschrieben, kombinieren Sie die Reagenzien für einstufige RT-PCR in PCR-Röhren. Legen Sie die PCR-Röhren in den Thermocycler und führen Sie den Thermocycler aus.
Führen Sie mikrochip Elektrophorese und berechnen Sie die Exon-Skipping-Effizienz. UDCs wurden leicht und nicht invasiv gesammelt und bildeten Kolonien innerhalb einer Woche der Primärkultur. MYOD1 transfizierte UDCs im Differenzierungsmedium mit DZNep konnten sich miteinander verschmelzen und bildeten multinukleierte Myotuben effizient.
RT-PCR erkannte eindeutig Exon-Skipping in MYOD1-UDCs, die von Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie abgeleitet wurden. Das Überspringen der Effizienz war abhängig von der Dosis von ASO. Dosisabhängiges Exon-Springen wurde auch von Western Blot erkannt.
Die Intensitäten von Dystrophin wurden eine Woche nach der ASO-Transfektion mit dem Fluoreszenzmikroskop gemessen. Deutlich höhere Fluoreszenzsignale wurden bei MYOD1-UDCs beobachtet, die mit ASO behandelt wurden, als bei der Steuerung. Wir können jede Muskelerkrankung modellieren, die zum Verständnis der Pathophysiologie dieser Krankheiten führt.
