私たちのプロトコルは、脊椎リンパ管とその排出リンパ節の3次元および大規模なビューを提供し、リンパドレナージおよび免疫細胞のリンパ管交通の研究を促進する。iDISCO+クリアリングプロトコルは組織の完全性を維持し、脊髄、髄膜、硬膜外腔および排出リンパ節を含む脊椎列の神経、血管および免疫細胞の局在化を可能にする。8~12週齢のマウスでペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、マウスをステレオタクシックフレームに入れる。
そして、メスを使用して、計画された注射のために適切な領域で皮膚切開を行います。脊髄アダプターを使用して、Th12-L1椎骨レベルで脊髄を固定化し、頸部および柱を覆う副頸部または脊髄筋を鈍く解剖して硬膜の表面を視覚化する。その後、26ゲージの針を使用して、硬膜の中央部と敷設下も膜を慎重に区切ります。
次に、ガラスの毛管先端から2ミリメートルを切断し、10マイクロリットルの注射器に接続されたカニューレに毛細管を接続します。選択した蛍光トレーサーの2〜8マイクロリットルでマイクロキャピラリーをロードします。そして、計画された注入のための適切な角度で硬膜の内側領域にマイクロキャピラリーを導入する。
毛細管を硬膜の下に1.5ミリメートル押し、外科用接着剤の10マイクロリットルで毛細血管の周りの切開を閉じます。接着剤が乾燥したら、1分間に1マイクロリットルの速度で蛍光トレーサーをゆっくりと注入する。全容が送達されたら、マイクロキャピラリーを引き込む前に1分間キャピラリーを所定の位置に置いておく。
そして、追加の接着剤で注入穴を閉じます。注射後の適切な時点で、解剖はさみを使用して下腹部から胸部ケージへの皮膚および腹膜切開を行う。胸部ケージを開けて心臓にアクセスし、26ゲージ針を心臓の左心室に挿入します。
PBSでは20ミリリットルの氷冷4%パラホルムアルデヒドを1分間に2ミリリットルの割合でパーフューズする。そして、迅速に灌流流体流れを解放する右心房を切断するためにはさみを使用してください。鉗子を使用して皮膚を完全に取り除き、はさみで手足を取り除きます。
すべての内臓を取り除き、リンパ節をそのままにして肋骨を切ります。解剖した組織を氷冷4%パラホルムアルデヒドに浸し、PBS内の個々の50ミリリットルチューブを摂氏4度で一晩、固定組織を新鮮なPBSの50ミリリットルで3回洗浄する前に、1回の洗浄につき5分間浸す。iDISCO+標識の場合、最初に、PBSでメタノールの上昇濃度に連続浸漬して組織を脱水し、室温での攪拌で浸漬ごとに1時間行います。
最後の浸漬後、33%メタノール中のサンプルをインキュベートし、66%ジクロロメタン溶液を攪拌しながら一晩。翌朝、室温で1回1時間、100%メタノールでサンプルを2回洗浄します。その後、メタノールの過酸化水素5%で摂氏4度で一晩インキュベーションを行った。
翌朝、室温で撹拌しながら、PBS中のメタノールの降水濃度で、濃度1時間ずつ順次浸漬してサンプルを徐々に水分補給します。椎骨を脱カルシウムするには、モールス溶液中のサンプルを室温で30分間インキュベートします。続いて、PBSで2リンス、PBSで0.2%トリトンX-100で2回、1時間のインキュベーションを行い、室温で攪拌した。
2回目のTriton X-100インキュベーション後、摂氏37度で24時間透過液でサンプルを処理します。その後、摂氏37度でブロッキング溶液に24時間インキュベーションを行う。ブロッキング溶液の最後にサンプルを一次抗体で標識し、PBSで0.2%Tween-20および0.1%ヘパリンで希釈し、5%ジメチルスルホキシドおよび3%ロバ血清溶液を摂氏37度で6日間添加した。
インキュベーションの終わりに、攪拌で室温で洗浄1回PBSで新鮮な2%Tween-20と0.1%ヘパリンで4〜5夜インキュベーションでサンプルを洗浄します。次に、原稿の指示に従って二次抗体でサンプルをインキュベートします。最後の洗浄後、PBS中のメタノールの上昇濃度で連続した浸漬でサンプルを脱水し、1回の濃度で1時間処理する。
続いて、33%メタノール66%ジクロロメタン溶液中で一晩インキュベーションを行った。翌朝、15分間のジクロロメタン洗浄を2回でサンプルを洗います。そして、4時間振ることなく、ジベンジルエーテルでサンプルをクリアします。
光シート蛍光顕微鏡イメージングの場合、クリアされたサンプルを顕微鏡ステージのトランスバーサル平面に4X、0.3の目的で配置します。そして、動的な焦点を合わせることなく、固定X位置を持つ片面3枚のシート除去構成を選択します。561ナノメートルと100ミリワットと639ナノメートルと70ミリワットにチューニングされたLEDレーザーを使用してください。
とライトシートの開口を0.03に設定します。適切な排出フィルターをセットし、顕微鏡室にジベンジルエーテルを充填します。次に、カメラを使用して、2.5マイクロメートルのZスタックと、2つのX光学ズームと1ピクセル当たり0.8マイクロメートルを使用して、ステップあたり30ミリ秒の露光時間を持つスタックを取得します。
そして、フルフレームで10%のオーバーラップでモザイクの取得を実行します。TIF形式の画像を取得し、適切なフル変換ソフトウェアプログラムで3D形式に変換します。Stitcherソフトウェアでモザイクの取得を再構築するには、画像を開き、画像全体を再構成するために画像を手動で配置し、画像間の10%の重複をガイドとして使用します。
次に、3D ソフトウェアを使用して、データの直交投影を生成します。リンパ管および展示されている他の解剖学的構造に色コード属性を追加する。光シート蛍光顕微鏡から得られた生データに1.47のガンマ補正を設定した。
メーカーの指示に従って。iDISCO+とライトシート蛍光顕微鏡の組み合わせは、椎骨解剖学を保存し、周囲の骨、靭帯、筋肉および神経節内のリンパ管の捕捉を可能にする。小さな赤色蛍光トレーサーを脳脊髄液、水槽マグナ、または脊髄の胸部領域のいずれかに注入すると、注射後45分の深い頸部リンパ節内にトレーサーが蓄積し、リンパ系によるトレーサーの取り込みおよび排出を示す。
胸部脊椎組織へのトレーサー注射は、脊髄組織内および深い頸部排出リンパ節内のトレーサー蓄積をもたらすが、抗LYVE-1抗体で標識された頸部および胸部リンパ管系には含まれていない。脊髄小小菌への抗LYVE注射は、椎体リンパ管および椎外リンパ接続の両方の標識をもたらす。椎体リンパ管によるトレーサー取り込みと、椎体外リンパ系に向けたリンパドレナージを立証する。
CSF循環を妨げないように、トレース注入を非常に慎重に行ってください。iDISCO+プロトコルは非常に不愉快ですが、サンプルのサイズに適応する必要があります。中枢神経系免疫染色またはライブイメージング実験への微量注射後、AUS行うことができる。
iDISCO+プロトコルは、さまざまな細胞、集団、組織を研究するために使用することができます。
