Il nostro protocollo fornisce viste tridimensionali e su larga scala dei vasi linfatici vertebrali e dei loro linfonodi drenante, facilitando lo studio del drenaggio linfatico e del traffico linfatico delle cellule immunitarie. Il protocollo di compensazione iDISCO+ preserva l'integrità dei tessuti, consentendo la localizzazione delle cellule neurali, vascolari e immunitarie della colonna vertebrale, tra cui il midollo spinale, le meningi, lo spazio epidurale e i linfonodi drenante. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale in un mouse anestetizzato di 8-12 settimane, posizionare il mouse in una cornice stereotassica.
E utilizzare un bisturi per fare un'incisione cutanea nella regione appropriata per l'iniezione pianificata. Utilizzare un adattatore spinale per immobilizzare il midollo spinale a livello vertebrale Th12-L1 e sezionare contundente i muscoli paracervicali o paraspinali che coprono il collo e la colonna per visualizzare la superficie del mater dura. Quindi utilizzare un ago calibro 26 per punteggiare attentamente l'area centrale del dura mater e l'aracnoide sotto-posa.
Quindi, tagliare due millimetri da una punta capillare di vetro e collegare il capillare a una cannula collegata a una siringa da 10 microlitri. Caricare il micro capillare con da due a otto microlitri del tracciante fluorescente di scelta. E introdurre un micro capillare nella regione mediale della dura madre all'angolo appropriato per l'iniezione pianificata.
Spingendo il capillare 1,5 millimetri sotto la dura madre, chiudere l'incisione intorno al capillare con 10 microlitri di colla chirurgica. Quando la colla si è asciugata lentamente iniettare il tracciante fluorescente ad una velocità di un microlitro al minuto. Quando l'intero volume è stato consegnato lasciare il capillare in posizione per un minuto prima di ritrarre il micro-capillare.
E chiudere il foro di iniezione con colla aggiuntiva. Nel momento appropriato dopo l'iniezione utilizzare le forbici di dissezione per fare la pelle e le incisioni peritoneali dall'addome inferiore alla gabbia toracica. Aprire la gabbia toracica per accedere al cuore e inserire un ago calibro 26 nel ventricolo sinistro del cuore.
Perfondere con 20 millilitri di ghiaccio freddo 4% paraformaldeide in PBS, ad una velocità di due millilitri al minuto. E usa le forbici per tagliare rapidamente l'atrio destro rilasciando il flusso di fluido perfusione. Utilizzare le forcep per rimuovere completamente la pelle e rimuovere gli arti con le forbici.
Rimuovere tutti gli organi interni, facendo attenzione a lasciare intatti i linfonodi e tagliare le costole. Immergere i tessuti sezionati in paraformaldeide ghiacciata al 4% in PBS in singoli tubi da 50 millilitri durante la notte a quattro gradi Celsius, prima di lavare i tessuti fissi tre volte in 50 millilitri di PBS fresco, per cinque minuti per lavaggio. Per l'etichettatura iDISCO+ di campioni integrali, disidratare i tessuti con immersioni successive in concentrazioni ascendenti di metanolo in PBS per un'ora per immersione con agitazione a temperatura ambiente.
Dopo l'ultima immersione incubare i campioni in una soluzione al 33% di metanolo, 66% di clorometano durante la notte con agitazione. La mattina seguente, lavare i campioni due volte con metanolo al 100% per un'ora per lavaggio a temperatura ambiente. Seguito da un'incubazione notturna in perossido di idrogeno al 5% in metanolo a quattro gradi Celsius.
La mattina seguente reidratare gradualmente i campioni in immersioni sequenziali in concentrazioni decrescenti di metanolo in PBS per un'ora per concentrazione con agitazione a temperatura ambiente. Per decalcificare le vertebre incubare i campioni nella soluzione di Morse per 30 minuti a temperatura ambiente. Seguito da due risciacqui in PBS e due incubazioni di un'ora, nello 0,2%Triton X-100 in PBS, con agitazione a temperatura ambiente.
Dopo la seconda incubazione tritone X-100, trattare i campioni con soluzione di permeabilizzazione per 24 ore a 37 gradi Celsius. Seguito da un'incubazione 24 ore su 24 nella soluzione di blocco a 37 gradi Celsius. Al termine dell'etichetta di incubazione della soluzione di blocco i campioni con anticorpo primario, diluiti in una soluzione di siero di 0,2% Tween-20 e 0,1% in PBS integrata con 5%dimetil solfossido e 3% di siero d'asino a 37 gradi Celsius per sei giorni.
Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con da quattro a cinque incubazioni notturne in fresco 2%Tween-20 e 0,1% di eparina in PBS per lavaggio a temperatura ambiente con agitazione. Quindi incubare i campioni con anticorpi secondari secondo le indicazioni manoscritte. Dopo l'ultimo lavaggio disidratare i campioni con immersioni successive in concentrazioni ascendenti di metanolo in PBS per un'ora per concentrazione.
Seguito da un'incubazione notturna in soluzione di diclorometano al 33% di metanolo 66%. La mattina dopo, lavare i campioni con due lavaggi diclorometano di 15 minuti. E cancellare i campioni in etere dibenzile senza tremare per quattro ore.
Per l'imaging di microscopia a fluorescenza a fogli chiari posizionare i campioni cancellati in un piano trasversale nella fase del microscopio sotto un obiettivo 4X, 0.3. E selezionare una configurazione a eliminazione a tre fogli a lato singolo con una posizione X fissa senza messa a fuoco dinamica. Utilizzare laser a LED sintonizzati su 561 nanometri e 100 milliwatt e 639 nanometri e 70 milliwatt.
E impostare l'apertura numerica del foglio luminoso su 0,03. Impostare i filtri di emissione appropriati e riempire la camera del microscopio con etere dibenzile. Successivamente, usa la fotocamera per acquisire pile con stack Z da 2,5 micrometri e un tempo di esposizione di 30 millisecondi per passo utilizzando i due zoom ottici X e 0,8 micrometri per pixel.
Ed eseguire le acquisizioni di mosaici con una sovrapposizione del 10% sull'intera cornice. Acquisisci immagini in formato TIF e convertile in formato 3D con un appropriato programma software di conversione completo. Per ricostruire l'acquisizione dei mosaici con il software Stitcher aprire le immagini e disporre manualmente le immagini per ricostituire l'intera immagine del mosaico, utilizzando la sovrapposizione del 10% tra le immagini come guida.
Quindi utilizzare il software 3D per generare proiezioni ortogonali dei dati. Aggiunta di un attributo di codice colore ai vasi linfatici e alle altre strutture anatomiche esposte. E impostare una correzione gamma di 1,47 ai dati grezzi ottenuti dalla microscopia a fluorescenza della scheda luminosa.
secondo le istruzioni del produttore. La combinazione di iDISCO+ con microscopia a fluorescenza a fogli leggeri preserva l'anatomia vertebrale e consente la cattura della vascuola linfatica all'interno delle ossa, dei legamenti, dei muscoli e dei gangli nervosi circostanti. L'iniezione di un piccolo tracciante fluorescente rosso nel liquido spinale cerebrale, nella cisterna magna o nella regione toracombare del midollo spinale provoca l'accumulo di tracciante all'interno dei linfonodi cervicali profondi 45 minuti dopo l'iniezione, indicando l'assorbimento e il drenaggio del tracciante da parte del sistema linfatico.
L'iniezione di tracciante nel parenchima spinale toracombare provoca accumulo di tracciante all'interno dei tessuti del midollo spinale e linfonodi drenante cervicale profondo, ma non nella vascuola linfatica cervicale e toracica etichettata con anticorpi anti-LYVE-1. L'iniezione anti-LYVE nel parenchima spinale toracombare provoca l'etichettatura sia dei linfatici vertebrali che delle loro connessioni linfatiche extra-vertebrali. Comprovante l'assorbimento del tracciante da parte dei vasi linfatici vertebrali e il drenaggio linfatico verso il sistema linfatico extra-vertebrale.
Eseguire l'iniezione di traccia con molta attenzione per non disturbare la circolazione del CSF. Il protocollo iDISCO+ è molto ufficioso ma è necessario adattarsi alle dimensioni dei campioni. Dopo l'iniezione di tracce nel sistema nervoso centrale, la colorazione immunitaria o l'esperimento di imaging dal vivo possono essere eseguiti da AUS.
Il protocollo iDISCO+ può essere utilizzato per studiare diverse cellule, popolazioni e tessuti.
