Unser Protokoll bietet dreidimensionale und großflächige Ansichten von Wirbellymphgefäßen und deren entwässernden Lymphknoten und erleichtert die Untersuchung der Lymphdrainage und des Lymphverkehrs von Immunzellen. Das iDISCO+Clearing-Protokoll bewahrt die Gewebeintegrität und ermöglicht die Lokalisierung der Nerven-, Gefäß- und Immunzellen der Wirbelsäule, einschließlich Rückenmark, Hirnhirn, Epiduralraum und entwässernder Lymphknoten. Nachdem Sie einen Mangel an Reaktion auf Pedalreflex in einer anästhesierten 8 bis 12 Wochen alten Maus bestätigt haben, legen Sie die Maus in einen stereotaxic Rahmen.
Und verwenden Sie ein Skalpell, um einen Hautschnitt in der entsprechenden Region für die geplante Injektion zu machen. Verwenden Sie einen Spinaladapter, um das Rückenmark auf der Wirbelebene Th12-L1 zu immobilisieren und die parazervikalen oder paraspinalen Muskeln, die den Hals und die Säule bedecken, stumpf zu sezieren, um die Oberfläche des Dura mater sezieren. Dann verwenden Sie eine 26-Spur-Nadel, um den zentralen Bereich der Dura mater und Unterverlegung Arachnoid sorgfältig zu punktieren.
Als nächstes zwei Millimeter von einer Glaskapillarspitze schneiden und die Kapillare mit einer Kanüle verbinden, die mit einer 10-Mikroliter-Spritze verbunden ist. Beladen Sie die Mikrokapillare mit zwei bis acht Mikrolitern des fluoreszierenden Tracers der Wahl. Und führen Sie eine Mikrokapillare in den medialen Bereich der Dura mater in dem geeigneten Winkel für die geplante Injektion ein.
Schieben Sie die Kapillare 1,5 Millimeter unter die Dura mater, schließen Sie den Schnitt um die Kapillare mit 10 Mikroliter chirurgischen Leim. Wenn der Kleber getrocknet ist, injizieren Sie den fluoreszierenden Tracer langsam mit einer Rate von einem Mikroliter pro Minute. Wenn das gesamte Volumen geliefert wurde, lassen Sie die Kapillare für eine Minute an Ort und Stelle, bevor Sie die Mikrokapillare einziehen.
Und schließen Sie das Injektionsloch mit zusätzlichem Kleber. Verwenden Sie zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Injektion eine Sezierschere, um Haut- und Peritonealschnitte vom Unterbauch bis zum Brustkorb herzustellen. Öffnen Sie den Brustkorb, um auf das Herz zuzugreifen, und setzen Sie eine 26-Spur-Nadel in die linke Herzkammer ein.
Perfuse mit 20 Millilitereiskaltes 4%Paraformaldehyd in PBS, mit einer Rate von zwei Millilitern pro Minute. Und verwenden Sie eine Schere, um schnell das rechte Atrium zu schneiden, das den Perfusionsflüssigkeitsstrom freisetzt. Verwenden Sie Zangen, um die Haut vollständig zu entfernen und die Gliedmaßen mit einer Schere zu entfernen.
Entfernen Sie alle inneren Organe, wobei Sie darauf achten, die Lymphknoten intakt zu lassen und die Rippen zu schneiden. Tauchen Sie das sezierte Gewebe in eiskalte4%Paraformaldehyd in PBS in einzelnen 50 Milliliter-Röhren über Nacht bei vier Grad Celsius ein, bevor Sie das feste Gewebe dreimal in 50 Milliliter frisches PBS waschen, für fünf Minuten pro Wäsche. Für die iDISCO+-Kennzeichnung von Vollmontageproben zuerst das Gewebe mit aufeinanderfolgenden Eintauchen in aufsteigenden Methanolkonzentrationen in PBS für eine Stunde pro Eintauchen mit Rührung bei Raumtemperatur dehydrieren.
Nach dem letzten Eintauchen inkubieren die Proben in einem 33%methanol, 66%dichlormeme Lösung über Nacht mit Rührung. Am nächsten Morgen die Proben zweimal mit 100% Methanol für eine Stunde pro Waschgang bei Raumtemperatur waschen. Gefolgt von einer nächtlichen Inkubation in 5% Wasserstoffperoxid in Methanol bei vier Grad Celsius.
Am nächsten Morgen rehydrieren Die Proben nach und nach in sequenziellen Eintauchen in absteigende Konzentrationen von Methanol in PBS für eine Stunde pro Konzentration mit Rührung bei Raumtemperatur. Um die Wirbel zu entkalken, brüten die Proben in Morses Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Gefolgt von zwei Spülungen in PBS und zwei, einstündigen Inkubationen, in 0,2%Triton X-100 in PBS, mit Aufregung bei Raumtemperatur.
Nach der zweiten Triton X-100 Inkubation, behandeln Sie die Proben mit Permeabilisationslösung für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Gefolgt von einer 24-stündigen Inkubation in Blockierlösung bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Blockierenden Lösung inkubieren Etikettieren Sie die Proben mit primärem Antikörper, verdünnt in einem 0,2%Tween-20 und 0,1%heparin in PBS, ergänzt mit 5%dimethylsulfoxid und 3%esel Serumlösung bei 37 Grad Celsius für sechs Tage.
Am Ende der Inkubation die Proben mit vier bis fünf Übernachtungsinkubationen in frischen 2%Tween-20 und 0,1%heparin in PBS pro Waschgang bei Raumtemperatur mit Rührung waschen. Dann inkubieren Sie die Proben mit sekundären Antikörpern nach Manuskriptrichtungen. Nach der letzten Waschdehydrierung Proben mit aufeinanderfolgenden Eintauchen in aufsteigende Konzentrationen von Methanol in PBS für eine Stunde pro Konzentration.
Gefolgt von einer nächtlichen Inkubation in 33%methanol 66%dichlormemethane Lösung. Am nächsten Morgen die Proben mit zwei 15-minütigen Dichlormethanwäschen waschen. Und die Proben in Dibenzylether ohne Schütteln für vier Stunden löschen.
Für die Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie-Bildgebung platzieren die gelöschten Proben in einer Transversalebene in der Mikroskopstufe unter einem 4X, 0,3 Objektiv. Und wählen Sie eine einseitige Drei-Blatt-Eliminierungskonfiguration mit einer festen X-Position ohne dynamische Fokussierung aus. Verwenden Sie LED-Laser mit 561 Nanometern und 100 Milliwatt und 639 Nanometern und 70 Milliwatt.
Und stellen Sie die numerische Blende des Lichtbogens auf 0,03 ein. Stellen Sie die entsprechenden Emissionsfilter ein und füllen Sie die Mikroskopkammer mit Dibenzylether. Verwenden Sie als Nächstes die Kamera, um Stapel mit 2,5 Mikrometer Z-Stacks und einer Belichtungszeit von 30 Millisekunden pro Schritt mit den beiden optischen X-Zoom- und 0,8 Mikrometern pro Pixel zu erfassen.
Und führen Sie die Mosaik-Anschaffungen mit einer 10%-Überlappung auf dem gesamten Frame durch. Erfassen Sie Bilder im TIF-Format und konvertieren Sie sie mit einem entsprechenden vollständigen Konvertierungssoftwareprogramm in s3D-Format. Um die Mosaikaufnahme mit Stitcher-Software zu rekonstruieren, öffnen Sie die Bilder und ordnen Sie die Bilder manuell an, um das gesamte Mosaikbild zu rekonstruieren, wobei die 10%-Überlappung zwischen den Bildern als Leitfaden verwendet wird.
Verwenden Sie dann 3D-Software, um orthogonale Projektionen der Daten zu generieren. Hinzufügen eines Farbcodeattributs zu den Lymphgefäßen und den anderen angezeigten anatomischen Strukturen. Und setzte eine Gammakorrektur von 1,47 auf die Rohdaten aus der Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie.
gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Kombination von iDISCO+mit Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie bewahrt die Wirbelanatomie und ermöglicht den Abfang der lymphatischen Vaskulatur in den umgebenden Knochen, Bändern, Muskeln und Nervenganglien. Die Injektion eines kleinen roten fluoreszierenden Tracers in die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit, die Zisterne magna oder den Thorakolumbarbereich des Rückenmarks führt 45 Minuten nach der Injektion zu einer Tracer-Akkumulation innerhalb der tiefen zervikalen Lymphknoten, was auf die Aufnahme und Drainage des Tracers durch das Lymphsystem hinweist.
Die Tracer-Injektion in das Thorakolumbar-Spinalparenchyma führt zu einer Tracer-Akkumulation innerhalb des Rückenmarksgewebes und der tiefen zervikalen Drainage-Lymphknoten, jedoch nicht in der zervikalen und thorakalen Lymphvaskulatur, die mit Anti-LYVE-1-Antikörpern gekennzeichnet ist. Die Anti-LYVE-Injektion in das Thorakolumbar-Spinalparenchym führt zur Kennzeichnung sowohl der Wirbellymphatik als auch ihrer extrawirbellichen lymphatischen Verbindungen. Substantiierung der Traceraufnahme durch Wirbellymphgefäße und der lymphatischen Drainage in Richtung des extravertebralen Lymphsystems.
Führen Sie die Spureninjektion sehr sorgfältig durch, um diese CSF-Zirkulation nicht zu stören. Das iDISCO+Protokoll ist sehr officious, aber Sie müssen sich an die Größe Ihrer Proben anpassen. Nach der Spureninjektion in das Zentralnervensystem können Immunfärbungen oder Live-Bildgebungsexperimente AUS-durchgeführt werden.
Das iDISCO+Protokoll kann verwendet werden, um verschiedene Zellen, Populationen und Gewebe zu untersuchen.
