Protokolümüz vertebral lenfatik damarların ve bunların drenajlı lenf düğümlerinin üç boyutlu ve büyük ölçekli görünümlerini sağlayarak lenfdrenajve immün hücrelerin lenfatik trafiğinin incelenmesini kolaylaştırıyor. iDISCO+temizleme protokolü doku bütünlüğünü koruyarak vertebral kolondaki nöral, vasküler ve immün hücrelerin omurilik, menenjler, epidural alan ve drenaj lenf düğümleri dahil lokalizasyonuna olanak sağlar. Anestezi8 ila 12 haftalık bir farede pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra fareyi stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin.
Ve planlanan enjeksiyon için uygun bölgede bir deri kesi yapmak için bir neşter kullanın. Th12-L1 vertebradüzeyinde omurilik immobilize ve dura mater yüzeyini görselleştirmek için boyun ve sütun kapsayan paraservikal veya paraspinal kasları künt diseksiyon için bir spinal adaptör kullanın. Sonra dikkatle dura mater ve under-döşeme araknoid merkezi alanı noktalamak için 26 gauge iğne kullanın.
Sonra, bir cam kılcal uçtan iki milimetre kesip kılcal damarı 10 mikrolitrelik şırıngaya bağlı bir kanüle bağlayın. Mikro kılcal damarı, tercih edilen floresan izleyicinin 2-8 mikrolitresi ile yükleyin. Ve planlanan enjeksiyon için uygun açıda dura mater medial bölgeye bir mikro kılcal tanıtmak.
Kılcal damarı dura materin 1,5 milimetre altına iterek, kılcal damarın etrafındaki kesiği 10 mikrolitre cerrahi tutkalla kapatın. Tutkal yavaş yavaş kuruduktan sonra dakikada bir mikrolitre hızında floresan izleyici enjekte edin. Tüm hacim teslim edildiğinde mikro-kılcal geri çekmeden önce bir dakika için yerinde kılcal bırakın.
Ve ek tutkal ile enjeksiyon deliğini kapatın. Enjeksiyondan sonra uygun zaman noktasında alt karından göğüs kafesine deri ve periton kesileri yapmak için diseksiyon makas kullanın. Kalbe erişmek için göğüs kafesini açın ve kalbin sol ventrikülüne 26 kalibrelik bir iğne yerleştirin.
Perfuse 20 mililitre buz gibi soğuk %4 paraformaldehit pbs, dakikada iki mililitre oranında. Ve hızla perfüzyon sıvı akışı serbest sağ atriyum kesmek için makas kullanın. Tamamen deri kaldırmak ve makas ile bacaklar kaldırmak için forceps kullanın.
Tüm iç organları çıkarın, lenf düğümleri bozulmadan bırakmak ve kaburga kesmek için özen. Kırık dokuları buz gibi 4%paraformaldehit pbs bireysel 50 mililitre tüpler de dört derece santigrat gecede batırın, taze PBS 50 mililitre üç kez sabit dokuları yıkamak için önce, yıkama başına beş dakika. Önce tüm montaj lı numunelerin iDISCO+labeling için, oda sıcaklığında ajitasyon ile daldırma başına bir saat boyunca PBS metanol artan konsantrasyonlarında art arda daldırma ile dokuları dehydrate.
Son daldırma sonra ajitasyon ile bir gecede% 33 metanol,% 66 diklorotan çözeltisi örnekleri inkübün. Ertesi sabah, oda sıcaklığında yıkama başına bir saat boyunca% 100 metanol ile örnekleri iki kez yıkayın. Ardından metanolde %5 hidrojen peroksitle dört santigrat derecede bir gecede kuluçka.
Ertesi sabah oda sıcaklığında ajitasyon ile konsantrasyon başına bir saat pbs metanol inen konsantrasyonlarda kademeli olarak örnekleri rehydrate. Omurları dekalsite etmek için Mors çözeltisindeki numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. PBS'de iki rinses ve iki, bir saatlik kuluçka, PBS%0.2 Triton X-100, oda sıcaklığında ajitasyon ile izledi.
İkinci Triton X-100 kuluçkadan sonra, numuneleri 37 santigrat derecede 24 saat permeabilizasyon solüsyonu ile tedavi edin. Ardından 37 santigrat derecede 24 saatlik bir kuluçka çözümü var. Bloke çözeltisi kuluçka etiketi sonunda birincil antikor ile örnekler, pbs bir 0.2% Tween-20 ve 0.1% heparin seyreltilmiş 5% dimetil sülfoksit ve 3% eşek serum çözeltisi ile takviye 37 derece santigrat altı gün.
Kuluçka sonunda, numuneleri dört ila beş gecelik kuluçka ile taze %2'lik Tween-20 ve PBS'de %0,1 heparin ile oda sıcaklığında ajitasyon la yıkayın. Daha sonra el yazması talimatlara göre ikincil antikorlar ile örnekleri kuluçkaya yatırın. Son yıkama dan sonra konsantrasyon başına bir saat için PBS metanol artan konsantrasyonlarda ardışık daldırma ile örnekleri dehydrate.
%33 metanol %66 diklorometan çözeltisi bir gecede kuluçka izledi. Ertesi sabah, iki 15 dakikalık diklorometan yıkama ile örnekleri yıkayın. Ve dört saat boyunca sallayarak olmadan dibenzyl eter örnekleri temizleyin.
Hafif sac floresan mikroskop görüntülemesi için temizlenmiş numuneleri mikroskop aşamasında 4X, 0.3 objektif bir transversal düzlemde yer. Dinamik odaklama olmadan sabit bir X konumuna sahip tek taraflı üç sayfa eleme yapılandırması seçin. 561 nanometre ve 100 miliwatt ve 639 nanometre ve 70 miliwatt'a ayarlanmış LED lazerler kullanın.
Ve ışık sayfası sayısal diyafram ı 0.03 olarak ayarlayın. Uygun emisyon filtrelerini ayarlayın ve mikroskop odasını dibenzil eterle doldurun. Ardından, iki X optik zum ve piksel başına 0,8 mikrometre kullanarak 2,5 mikrometre Z yığınları ve adım başına 30 milisaniye lik pozlama süresine sahip yığınları elde etmek için kamerayı kullanın.
Ve tam kare üzerinde% 10 örtüşme ile mozaik alımları gerçekleştirin. Uygun bir tam dönüştürme yazılımı programıyla görüntüleri TIF biçiminde edinin ve 3B formatına dönüştürün. Stitcher yazılımı ile mozaik edinimi yeniden oluşturmak için görüntüleri açın ve el ile tüm mozaik resmi yeniden oluşturmak için görüntüleri düzenlemek, bir kılavuz olarak görüntüler arasında% 10 örtüşme kullanarak.
Sonra verilerin ortogonal projeksiyonlar oluşturmak için 3D yazılım kullanın. Ekranda lenfatik damarlar ve diğer anatomik yapılar ait bir renk kodu özelliği ekleme. Ve hafif sac floresan mikroskobundan elde edilen ham verilere 1.47 gama düzeltmesi ayarlayın.
üreticinin talimatlarına göre. Hafif levha floresan mikroskobu ile iDISCO + kombinasyonu vertebraan anatomisi korur ve çevreleyen kemikler, ligamentler, kaslar ve sinir gangliyonu içinde lenfatik vaskülatür yakalanmasını sağlar. Küçük bir kırmızı floresan izleyicinin ya serebral spinal sıvı, sarnıç magna ya da omurilik torakolombbar bölgesine enjeksiyonu, enjeksiyondan 45 dakika sonra derin servikal lenf düğümleri içinde izleyici birikimiile sonuçlanır ve bu da izleyicinin lenfatik sistem tarafından alımını ve drenajını gösterir.
Torakolombbar spinal parankim içine tracer enjeksiyonspinal kord dokuları ve derin servikal drenaj lenf düğümleri içinde tracer birikimi ile sonuçlanır, ancak servikal ve torasik lenfatik vaskülatür anti-LYVE-1 antikorları ile etiketli. Torakolombbar spinal parankim içine anti-LYVE enjeksiyonu hem vertebral lenfatiklerin hem de ekstra-vertebral lenfatik bağlantılarının etiketlenmesiyle sonuçlanır. Vertebral lenfatik damarlar ve ekstra vertebral lenfatik sisteme doğru lenfdrenaj tarafından tracer alımı nın kanıtlanması.
BOS dolaşımını bozmamak için izleme enjeksiyonunu çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. iDISCO+protokolü çok dinsizdir ancak örneklerinizin boyutuna uyum sağlamanız gerekir. Merkezi sinir sistemi içine iz enjeksiyon sonra bağışıklık boyama veya canlı görüntüleme deneyi AUS yapılabilir.
iDISCO+protokolü farklı hücreleri, popülasyonları ve dokuları incelemek için kullanılabilir.
