הפרוטוקול שלנו מספק תצוגות תלת מימדיות בקנה מידה גדול של כלי הלימפה החוליות ובלוטות הלימפה המתנקזות שלהם, להקל על המחקר של ניקוז הלימפה ואת התנועה הלימפתית של תאים חיסוניים. פרוטוקול iDISCO+clearing משמר את שלמות הרקמות ומאפשר לוקליזציה של תאי העצב, כלי הדם והמערכת החיסונית של עמוד השדרה, כולל חוט השדרה, קרום המוח, מרחב אפידורלי ובלוטות לימפה מתנקזות. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה בעכבר הרדמה 8 עד 12 שבוע, למקם את העכבר במסגרת סטריאוטקסית.
ולהשתמש באזמל כדי להפוך חתך בעור באזור המתאים להזרקה המתוכננת. השתמש במתאם עמוד השדרה כדי לשתק את חוט השדרה ברמת החוליות Th12-L1 ולפתוח את השרירים הצנחניים או הצנחניים המכסים את הצוואר ואת העמוד כדי לדמיין את פני השטח של דורה מאטר. לאחר מכן השתמש מחט מד 26 כדי לנקב בזהירות את האזור המרכזי של מאטר דורה ו ארכנואיד מתחת לשכיבה.
לאחר מכן, חותכים שני מילימטרים מקצה נימי זכוכית ולחבר את נימי ל cannula מקושר מזרק 10 מיקרוליטר. לטעון את נימי מיקרו עם שניים עד שמונה microliters של מעקב פלואורסצנטי של בחירה. ולהכניס נימי מיקרו לאזור המדילי של דורה מאטר בזווית המתאימה להזרקה המתוכננת.
דוחפים את נימי 1.5 מילימטרים מתחת מאטר דורה, לסגור את החתך סביב נימי עם 10 microliters של דבק כירורגי. כאשר הדבק התייבש לאט להזריק את מעקב פלואורסצנט בקצב של microliter אחד לדקה. כאשר הנפח כולו נמסר להשאיר את נימי במקום במשך דקה אחת לפני נסיגת המיקרו נימי.
ולסגור את חור ההזרקה עם דבק נוסף. בנקודת הזמן המתאימה לאחר ההזרקה להשתמש מספריים ניתוח כדי להפוך את העור חתכים צפי מהבטן התחתונה לכלוב בית החזה. פתח את כלוב בית החזה כדי לגשת ללב ולהכניס מחט מד 26 לתוך החדר השמאלי של הלב.
עם 20 מיליליטר של קרח קר 4% paraformaldehyde ב PBS, בקצב של שני מיליליטר לדקה. ולהשתמש במספריים לחתוך במהירות את אטריום הנכון משחרר את זרם נוזל זלבול. השתמש מדפים כדי להסיר לחלוטין את העור ולהסיר את הגפיים עם מספריים.
הסר את כל האיברים הפנימיים, דואג להשאיר את בלוטות הלימפה שלם לחתוך את הצלעות. לטבול את הרקמות נותחו בקרח 4% paraformaldehyde ב PBS בצינורות בודדים 50 מיליליטר לילה בארבע מעלות צלזיוס, לפני שטיפת הרקמות הקבועות שלוש פעמים ב 50 מיליליטר של PBS טרי, במשך חמש דקות לכל לשטוף. עבור iDISCO + תיוג של דגימות כל הר הראשון, לייבש את הרקמות עם טבילות רצופות בריכוזים עולים של מתנול ב PBS במשך שעה אחת לכל טבילה עם תסיסה בטמפרטורת החדר.
לאחר הטבילה האחרונה דגירה הדגימות ב 33% מתנול, 66% פתרון dichloromethane לילה עם תסיסה. למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות פעמיים עם 100% מתנול במשך שעה אחת לכל לשטוף בטמפרטורת החדר. ואחריו דגירה לילה ב 5% מי חמצן במתנול בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת בבוקר rehydrate הדגימות בהדרגה טבילות רציפות בריכוזים יורדים של מתנול ב PBS במשך שעה אחת לכל ריכוז עם תסיסה בטמפרטורת החדר. כדי לדקור את החוליות דגירה הדגימות בתסומה של מורס במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. אחריה שתי שטיפות ב-PBS ושתיים, דגירה של שעה, ב-0.2% טריטון X-100 ב-PBS, עם תסיסה בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה השנייה של טריטון X-100, לטפל בדגימות עם פתרון permeabilization במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. ואחריו דגירה 24 שעות ביממה בתסימת חסימה ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף דגירה פתרון חסימה תווית הדגימות עם נוגדן ראשוני, מדולל 0.2%Tween-20 ו 0.1% הפרין ב PBS בתוספת 5%dimethyl sulfoxide ו 3% פתרון סרום חמור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שישה ימים.
בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם ארבעה עד חמישה דגירה לילה טרי 2%Tween-20 ו 0.1% הפרין ב PBS לכל לשטוף בטמפרטורת החדר עם תסיסה. ואז להדגיר את הדגימות עם נוגדנים משניים על פי הוראות כתב היד. לאחר השטיפה האחרונה לייבש דגימות עם טבילות רצופות בריכוזים עולים של מתנול ב PBS במשך שעה אחת לכל ריכוז.
ואחריו דגירה לילה ב 33% מתנול 66% פתרון dichloromethane. למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות עם שתי שטיפות דיכלורומטן של 15 דקות. ולנקה את הדגימות אתר דיבנזיל בלי לרעוד במשך ארבע שעות.
להדמיית מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור, מקם את הדגימות המנוקות במישור רוחבי בשלב המיקרוסקופ תחת מטרה של 4X, 0.3. ובחר תצורת אי כלילה חד-צדדית של שלושה גיליון עם מיקום X קבוע ללא התמקדות דינמית. השתמש לייזרים LED מכוון 561 ננומטר ו 100 מילי וואט ו 639 ננומטר ו 70 מילי וואט.
והגדר את הצמצם המספרי של גיליון האור ל- 0.03. הגדר את מסנני הפליטה המתאימים ומלא את תא המיקרוסקופ עם אתר דיבנזיל. לאחר מכן, השתמש במצלמה כדי להשיג ערימות עם ערימות Z של 2.5 מיקרומטר וזמן חשיפה של 30 אלפיות שנייה לכל שלב באמצעות שני זום אופטי X ו- 0.8 מיקרומטר לפיקסל.
ולבצע את רכישות הפסיפס עם חפיפה של 10% על המסגרת המלאה. לרכוש תמונות בפורמט TIF ולהמיר אותם לפורמט 3D עם תוכנת המרה מלאה המתאימה. כדי לשחזר את רכישת הפסיפסים עם תוכנת Stitcher לפתוח את התמונות ולסדר באופן ידני את התמונות כדי לבנות מחדש את תמונת הפסיפס כולה, באמצעות 10%חפיפה בין התמונות כמדריך.
לאחר מכן השתמש בתוכנה תלת-מימדית כדי ליצור תחזיות אורתוגונליות של הנתונים. הוספת תכונת קוד צבע לכלי הלימפה והמבנים האנטומיים האחרים המוצגים. ולהגדיר תיקון גמא של 1.47 לנתונים הגולמיים המתקבלים ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעת האור.
בהתאם להוראות היצרן. השילוב של iDISCO +עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית גיליון אור משמר את האנטומיה החוליות ומאפשר לכידה של כלי הדם הלימפתי בתוך העצמות שמסביב, רצועות, שרירים וגנגסטרים עצביים. הזרקת מעקב פלואורסצנטי אדום קטן לתוך נוזל השדרה המוחי, מגנה cisterna או אזור thoracolumbar של חוט השדרה תוצאות הצטברות מעקב בתוך בלוטות הלימפה צוואר הרחם עמוק 45 דקות לאחר ההזרקה, המציין את ספיגת וניקוז של tracer על ידי מערכת הלימפה.
הזרקת מעקב לתוך parenchyma עמוד השדרה thoracolumbar תוצאות הצטברות מעקב בתוך רקמות חוט השדרה ובלוטות לימפה ניקוז צוואר הרחם עמוק, אבל לא בכלי הדם הלימפה צוואר הרחם ובית החזה שכותרתו נוגדנים נגד LYVE-1. הזרקת Anti-LYVE לתוך parenchyma עמוד השדרה thoracolumbar תוצאות תיוג של לימפה חולייתיים והקשרים הלימפתיים שלהם מחוץ לחוליות. תימוך ספיגת המעקב על ידי כלי הלימפה החוליות והניקוז הלימפתי לכיוון מערכת הלימפה החצנית.
בצע את הזרקת העקבות בזהירות רבה כדי לא להפריע כי זרימת CSF. פרוטוקול iDISCO + הוא מאוד officious אבל אתה צריך להסתגל לגודל של הדגימות שלך. לאחר הזרקת עקבות למערכת העצבים המרכזית ניתן לבצע ניסויי תכתמים במערכת העצבים המרכזית או הדמיה חיה.
ניתן להשתמש בפרוטוקול iDISCO+כדי לחקור תאים, אוכלוסיות ורקמות שונים.
