Nuestro protocolo proporciona vistas tridimensionales y a gran escala de los vasos linfáticos vertebrales y sus ganglios linfáticos drenantes, facilitando el estudio del drenaje linfático y el tráfico linfático de las células inmunitarias. El protocolo iDISCO+clearing preserva la integridad del tejido, permitiendo la localización de las células neuronales, vasculares e inmunitarias de la columna vertebral, incluyendo la médula espinal, las meninges, el espacio epidural y los ganglios linfáticos drenantes. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal en un ratón anestesado de 8 a 12 semanas de edad, coloque el ratón en un marco estereotaxico.
Y use un bisturí para hacer una incisión cutánea en la región apropiada para la inyección planificada. Utilice un adaptador espinal para inmovilizar la médula espinal a nivel vertebral Th12-L1 y diseccionar contundentemente los músculos paracervicales o paraspinales que cubren el cuello y la columna para visualizar la superficie de la dura mater. A continuación, utilice una aguja de calibre 26 para puntuar cuidadosamente el área central de la dura mater y el aracnoideo que se pone debajo.
A continuación, corte dos milímetros de una punta capilar de vidrio y conecte el capilar a una cánula conectada a una jeringa de 10 microlitros. Cargue el micro capilar con dos a ocho microlitros del trazador fluorescente de su elección. E introducir un micro capilar en la región medial de la dura mater en el ángulo adecuado para la inyección planificada.
Empujando el capilar 1,5 milímetros por debajo de la dura mater, cerrar la incisión alrededor del capilar con 10 microlitros de pegamento quirúrgico. Cuando el pegamento se haya secado lentamente, inyecte el trazador fluorescente a una velocidad de un microlitro por minuto. Cuando se haya entregado todo el volumen deje el capilar en su lugar durante un minuto antes de retraer el micro-capilar.
Y cierre el orificio de inyección con pegamento adicional. En el momento apropiado después de la inyección utilice tijeras de disección para hacer incisiones cutáneas y peritoneales desde la parte inferior del abdomen hasta la jaula torácica. Abra la jaula torácica para acceder al corazón e inserte una aguja de calibre 26 en el ventrículo izquierdo del corazón.
Perdate con 20 mililitros de hielo frío 4%paraformaldehído en PBS, a una velocidad de dos mililitros por minuto. Y usa tijeras para cortar rápidamente la aurícula derecha liberando el flujo de líquido de perfusión. Use fórceps para eliminar completamente la piel y quitar las extremidades con tijeras.
Retire todos los órganos internos, teniendo cuidado de dejar los ganglios linfáticos intactos y cortar las costillas. Sumergir los tejidos diseccionados en hielo frío 4%paraformaldehído en PBS en tubos individuales de 50 mililitros durante la noche a cuatro grados centígrados, antes de lavar los tejidos fijos tres veces en 50 mililitros de PBS fresco, durante cinco minutos por lavado. Para iDISCO+etiquetado de muestras de montaje integral primero, deshidratar los tejidos con inmersiones sucesivas en concentraciones ascendentes de metanol en PBS durante una hora por inmersión con agitación a temperatura ambiente.
Después de la última inmersión incubar las muestras en un 33%metanol, 66%solución de diclorometano durante la noche con agitación. A la mañana siguiente, lave las muestras dos veces con 100% metanol durante una hora por lavado a temperatura ambiente. Seguido de una incubación nocturna en 5%peróxido de hidrógeno en metanol a cuatro grados centígrados.
A la mañana siguiente rehidratar las muestras gradualmente en inmersiones secuenciales en concentraciones descendentes de metanol en PBS durante una hora por concentración con agitación a temperatura ambiente. Para descalcificar las vértebras incubar las muestras en la solución de Morse durante 30 minutos a temperatura ambiente. Seguido de dos enjuagues en PBS y dos incubaciones de una hora, en 0.2%Triton X-100 en PBS, con agitación a temperatura ambiente.
Después de la segunda incubación tritón X-100, tratar las muestras con solución de permeabilización durante 24 horas a 37 grados centígrados. Seguido de una incubación de 24 horas en solución de bloqueo a 37 grados Centígrados. Al final de la solución de bloqueo etiquetar las muestras con anticuerpo primario, diluidas en un 0,2%Tween-20 y 0,1% de heparina en PBS complementada con 5%sulfóxido de dimetil y 3%solución sérica de burro a 37 grados Celsius durante seis días.
Al final de la incubación, lave las muestras con cuatro a cinco incubaciones durante la noche en 2%Tween-20 y 0.1% heparina en PBS por lavado a temperatura ambiente con agitación. A continuación, incubar las muestras con anticuerpos secundarios de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Después del último lavado deshidratar muestras con inmersiones sucesivas en concentraciones ascendentes de metanol en PBS durante una hora por concentración.
Seguido de una incubación durante la noche en 33%metanol 66%solución de diclorometano. A la mañana siguiente, lave las muestras con dos lavados de diclorometano de 15 minutos. Y limpiar las muestras en éter de dibenzyl sin agitar durante cuatro horas.
Para la microscopía de fluorescencia de láminas de luz, coloque las muestras despejadas en un plano transversal en la etapa del microscopio bajo un objetivo 4X, 0.3. Y seleccione una configuración de eliminación de tres hojas de un solo lado con una posición X fija sin enfoque dinámico. Utilice láseres LED sintonizados a 561 nanómetros y 100 milivatios y 639 nanómetros y 70 milivatios.
Y ajuste la apertura numérica de la hoja de luz a 0.03. Ajuste los filtros de emisión adecuados y llene la cámara del microscopio con éter de dibenzilo. A continuación, utilice la cámara para adquirir pilas con pilas Z de 2,5 micrómetros y un tiempo de exposición de 30 milisegundos por paso utilizando el zoom óptico X y 0,8 micrómetros por píxel.
Y realizar las adquisiciones de mosaico con una superposición del 10% en el marco completo. Adquiera imágenes en formato TIF y conviértalas en formato 3D con un programa de software de conversión completo adecuado. Para reconstruir la adquisición de mosaicos con el software Stitcher, abra las imágenes y organice manualmente las imágenes para reconstituir toda la imagen de mosaico, utilizando la superposición del 10% entre las imágenes como guía.
A continuación, utilice el software 3D para generar proyecciones ortogonales de los datos. Adición de un atributo de código de color a los vasos linfáticos y las otras estructuras anatómicas en exhibición. Y establezca una corrección gamma de 1.47 a los datos brutos obtenidos de la microscopía de fluorescencia de la hoja de luz.
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La combinación de iDISCO+con microscopía de fluorescencia de láminas de luz preserva la anatomía vertebral y permite la captura de la vasculatura linfática dentro de los huesos circundantes, ligamentos, músculos y ganglios nerviosos. La inyección de un pequeño trazador fluorescente rojo en el líquido cefalorraquídeo, la cisterna magna o la región toracolumbar de la médula espinal da como resultado la acumulación de trazador dentro de los ganglios linfáticos cervicales profundos 45 minutos después de la inyección, lo que indica la absorción y el drenaje del trazador por el sistema linfático.
La inyección de trazador en el parénquima espinal toracolumbar da como resultado la acumulación de trazadores dentro de los tejidos de la médula espinal y los ganglios linfáticos de drenaje cervical profundo, pero no en la vasculatura linfática cervical y torácica etiquetada con anticuerpos anti-LYVE-1. La inyección anti-LYVE en el parénquima espinal toracolumbar da como resultado el etiquetado tanto de los linfáticos vertebrales como de sus conexiones linfáticas extra vertebrales. Sustanciando la absorción del trazador por los vasos linfáticos vertebrales y el drenaje linfático hacia el sistema linfático extra vertebral.
Realice la inyección de trazas con mucho cuidado para no perturbar esa circulación del CSF. El protocolo iDISCO+es muy officious pero necesita adaptarse al tamaño de sus muestras. Después de la inyección de trazas en el sistema nervioso central, la tinción inmune o el experimento de imágenes en vivo se pueden realizar aus.
El protocolo iDISCO+se puede utilizar para estudiar diferentes células, poblaciones y tejidos.
