Notre protocole fournit des vues tridimensionnelles et à grande échelle des vaisseaux lymphatiques vertébraux et de leurs ganglions lymphatiques drainants, facilitant l’étude du drainage lymphatique et du trafic lymphatique des cellules immunitaires. Le protocole de compensation iDISCO+preserve tissue integrity, permettant la localisation des cellules neurales, vasculaires et immunitaires de la colonne vertébrale, y compris la moelle épinière, les méninges, l’espace péridural et l’épuisement des ganglions lymphatiques. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale chez une souris anesthésiée de 8 à 12 semaines, placez la souris dans un cadre stéréotaxique.
Et utilisez un scalpel pour faire une incision cutanée dans la région appropriée pour l’injection prévue. Utilisez un adaptateur rachidien pour immobiliser la moelle épinière au niveau vertébral Th12-L1 et émousser disséquer les muscles paracervical ou paraspinal couvrant le cou et la colonne pour visualiser la surface du dura mater. Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 26 pour ponctuer soigneusement la zone centrale du dura mater et sous-pondre l’arachnoïde.
Ensuite, coupez deux millimètres à partir d’une pointe capillaire en verre et connectez le capillaire à une canule reliée à une seringue de 10 microlitres. Chargez le micro capillaire avec deux à huit microlitres du traceur fluorescent de choix. Et introduire un micro capillaire dans la région médiale du dura mater à l’angle approprié pour l’injection prévue.
Poussant les capillaires 1,5 millimètres sous le dura mater, fermez l’incision autour du capillaire avec 10 microlitres de colle chirurgicale. Lorsque la colle a séché lentement injecter le traceur fluorescent à un taux d’un microlitre par minute. Lorsque le volume entier a été livré, laissez le capillaire en place pendant une minute avant de rétracter le micro-capillaire.
Et fermez le trou d’injection avec de la colle supplémentaire. Au moment opportun après l’injection utiliser des ciseaux de dissection pour faire des incisions cutanées et péritonéales du bas-ventre à la cage thoracique. Ouvrez la cage thoracique pour accéder au cœur et insérez une aiguille de calibre 26 dans le ventricule gauche du cœur.
Perfuser avec 20 millilitres de glace froide 4% paraformaldéhyde dans PBS, à un taux de deux millilitres par minute. Et utilisez des ciseaux pour couper rapidement l’atrium droit libérant le flux de liquide de perfusion. Utilisez des forceps pour enlever complètement la peau et enlever les membres avec des ciseaux.
Retirer tous les organes internes, en prenant soin de laisser les ganglions lymphatiques intacts et couper les côtes. Immerger les tissus disséqués dans du paraformaldéhyde glacé à 4 % dans le PBS dans des tubes individuels de 50 millilitres pendant la nuit à quatre degrés Celsius, avant de laver les tissus fixes trois fois en 50 millilitres de PBS frais, pendant cinq minutes par lavage. Pour iDISCO+étiquetage des échantillons de montage entier d’abord, déshydratez les tissus avec des immersions successives dans des concentrations ascendantes de méthanol dans PBS pendant une heure par immersion avec agitation à température ambiante.
Après la dernière immersion, incuber les échantillons dans un méthanol à 33%, solution 66% dichloromethane pendant la nuit avec agitation. Le lendemain matin, lavez les échantillons deux fois avec 100% de méthanol pendant une heure par lavage à température ambiante. Suivi d’une incubation nocturne de 5% de peroxyde d’hydrogène dans le méthanol à quatre degrés Celsius.
Le lendemain matin, réhydrater graduellement les échantillons en immersion séquentielle dans des concentrations descendantes de méthanol dans le PBS pendant une heure par concentration avec agitation à température ambiante. Pour décalcifier les vertèbres, incuber les échantillons dans la solution morse pendant 30 minutes à température ambiante. Suivi de deux rinçages en PBS et deux incubations d’une heure, en 0,2%Triton X-100 en PBS, avec agitation à température ambiante.
Après la deuxième incubation du Triton X-100, traiter les échantillons avec une solution de perméabilisation pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Suivi d’une incubation de 24 heures dans la solution de blocage à 37 degrés Celsius. À la fin de l’étiquette d’incubation de la solution de blocage, les échantillons d’anticorps primaires, dilués dans un sulfoxide de 0,2 % tween-20 et 0,1 % d’héparine dans le PBS complétés par du sulfoxyde de diméthyle à 5 % et une solution de sérum d’âne à 37 degrés Celsius pendant six jours.
À la fin de l’incubation, laver les échantillons avec quatre à cinq incubations d’une nuit dans 2% d’interpolation-20 et 0,1% d’héparine en PBS par lavage à température ambiante avec agitation. Ensuite, incuber les échantillons avec des anticorps secondaires selon les instructions manuscrites. Après le dernier lavage, déshydrater les échantillons avec des immersions successives dans des concentrations ascendantes de méthanol dans PBS pendant une heure par concentration.
Suivi d’une incubation d’une nuit dans 33% de méthanol 66%solution dichloromethane. Le lendemain matin, lavez les échantillons avec deux lavages de dichloromethane de 15 minutes. Et effacer les échantillons dans l’éther dibenzyl sans trembler pendant quatre heures.
Pour l’imagerie par microscopie par fluorescence des feuilles lumineuses, placez les échantillons effacés dans un plan transversal au stade du microscope sous un objectif de 4X, 0,3. Et sélectionnez une configuration d’élimination à trois feuilles à un seul face avec une position X fixe sans mise au point dynamique. Utilisez des lasers LED réglés à 561 nanomètres et 100 milliwatts et 639 nanomètres et 70 milliwatts.
Et réglez l’ouverture numérique de la feuille de lumière à 0,03. Réglez les filtres d’émission appropriés et remplissez la chambre de microscope avec de l’éther dibenzyl. Ensuite, utilisez la caméra pour acquérir des piles avec des piles Z de 2,5 micromètres et un temps d’exposition de 30 millisecondes par étape à l’aide des deux zooms optiques X et de 0,8 micromètre par pixel.
Et effectuer les acquisitions de mosaïque avec un chevauchement de 10% sur l’ensemble du cadre. Acquérir des images en format TIF et les convertir en format 3D avec un logiciel de conversion complet approprié. Pour reconstruire l’acquisition de mosaïques avec le logiciel Stitcher ouvrir les images et organiser manuellement les images pour reconstituer l’image de mosaïque entière, en utilisant le chevauchement de 10% entre les images comme un guide.
Utilisez ensuite un logiciel 3D pour générer des projections orthogonales des données. Ajout d’un attribut de code couleur aux vaisseaux lymphatiques et aux autres structures anatomiques exposées. Et définir une correction gamma de 1,47 aux données brutes obtenues à partir de la microscopie de fluorescence feuille de lumière.
selon les instructions du fabricant. La combinaison d’iDISCO+, d’une microscopie à fluorescence des feuilles de lumière, préserve l’anatomie vertébrale et permet de capturer la vascularisation lymphatique dans les os, ligaments, muscles et ganglions nerveux environnants. L’injection d’un petit traceur fluorescent rouge dans le liquide céphalo-rachidien cérébral, la magna cisterna ou la région thoracolumbar de la moelle épinière entraîne une accumulation de traceurs dans les ganglions lymphatiques cervicals profonds 45 minutes après l’injection, ce qui indique l’absorption et le drainage du traceur par le système lymphatique.
L’injection de traceurs dans le parenchyme rachidien thoracolumbar entraîne une accumulation de traceurs dans les tissus de la moelle épinière et des ganglions lymphatiques drainants cervicaux profonds, mais pas dans la vascularisation lymphatique cervicale et thoracique étiquetée avec des anticorps anti-LYVE-1. L’injection d’anti-LYVE dans le parenchyme spinal thoracolumbar a comme conséquence l’étiquetage des lymphatics vertébraux et de leurs connexions lymphatiques extra-vertébrées. Étayer l’absorption du traceur par les vaisseaux lymphatiques vertébraux et le drainage lymphatique vers le système lymphatique extra-vertébral.
Effectuez l’injection de traces très soigneusement pour ne pas perturber cette circulation CSF. Le protocole iDISCO+est très officieux mais vous devez vous adapter à la taille de vos échantillons. Après l’injection de traces dans le système nerveux central, la coloration immunitaire ou l’expérience d’imagerie en direct peuvent être réalisées auS.
Le protocole iDISCO+peut être utilisé pour étudier différentes cellules, populations et tissus.
