本研究は、日本科学振興会(JSPS)の科学研究助成金17H05661および18K19903、コア2コアプログラム、およびビヨンドAI研究所によって支援されました。

<ol>
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この議定書の一部として、川田二郎が設立したジクサック・バイオエンジニアリング社に特許が認可されている。

このプロトコルは、ヒトiPS細胞から生成された運動ニューロンスフェロイドから伸長した軸索束を有する運動神経オルガノイド(MNO)の形成を記述する。形成された軸索束は厚く、適用範囲が広く、単方向構造でよく整理されている。軸索束を解剖することにより、生化学的分析のために高純度軸索タンパク質およびRNAを十分に得ることができる。ニューロン活性は、カルシウムイメージングを用いた軸索束およびスフェロイドで測定することができる。軸索リセート中の核タンパク質と樹状タンパク質の汚染は、ウェスタンブロッティングでは検出されず、我々の方法が効率的に軸索を細胞体と樹状突起から分離することを実証した。
このプロトコルの利点の1つは、3Dプロトコルで4週間、2Dプロトコルを使用して5-6週間ですべてのプロセスを行うことができる軸索バンドルを装備したMNOの急速な差別化と生成です。これは、通常、胚性幹細胞およびiPS細胞17 からMNに分化するのに3〜4週間かかる他のプロトコルと比較して短く、軸索伸長を得るのにさらに2〜4週間かかる。3D プロトコルは、2D プロトコルと比較して、分化時間が短く、手順が少なく、技術上のリスクが低減されるため、一般的に 2D プロトコルよりも好まれます。マイクロ流体ベースの組織培養チップは、MNSの軸索がマイクロチャネルを通じて他のコンパートメントに向かって伸びるように設計されており、アクソン間のアキソ軸索相互作用と親和性を誘発することによって軸索の束の形成を容易にする。単純な実験的なセットアップのために、ここで説明するすべてのプロトコルは、組織培養チップの操作に精通しているバイオエンジニアだけでなく、マイクロ流体および微細加工技術に精通していない生物学者や神経科学者によっても実行することができます。手順 1 および 2 は、外部ファブリケーション サービスを使用して実行することもできます。
プロトコルを実現するための重要な手順の 1 つに、培養メディアの順次変更があります。分化中の各工程で培養培地を完全に変更し、使用済み培地の因子がMN分化を妨げないようにすることが推奨される。このプロトコルのもう一つの重要なポイントは、未分化iPS細胞を良好な品質で維持することです。初期iPS細胞培養の品質は、運動ニューロンおよびMNOを得るための効率に大きく影響する。もう1つのポイントは、MNSの直径がチップの穴のサイズ(1.5mm)よりも小さくなるべきであるということです。より大きな回転楕円体はチャンバーに入ることができず、中央部に重度の低酸素壊死を経験する可能性がある。MNSのサイズは、iPS細胞の初期シード数(3Dプロトコル)または運動ニューロン(2Dプロトコル)を変更することで制御できます。細胞の播種密度は、各iPS細胞株に合わせて最適化する必要があります。
マイクログルーブと小さな細孔フィルターを備えた区画化されたマイクロ流体デバイスは、軸索を細胞体および樹状突起から分離するために広く使用されてきました。この技術はまた、細胞体および樹状突起から軸索を分離することができ、束ねられた組織の軸索の優れた豊富さ。他の方法と比較して、この方法の1つの大きな制限は、2つの異なる培地を必要とする2つの異なる細胞の共培養能力を妨げる組織培養チップの現在の設計において2つの異なる培養培地を分離できないことである。もう一つの制限は、PDMSチップが組織のサイズに所定の制限を置くということである。穴より大きい回転楕円体はチャンバに入ることができず、軸索束はマイクロ流体チャネルの幅よりも厚く成長することができません。
この方法は、他のタイプのニューロンに適用することができます。我々のグループは、大脳オルガノイド技術18と組み合わせた修飾法を用いて大脳管をモデル化する能力を示した。コルチカルスフェロイドは両方のコンパートメントに導入され、軸索は各スフェロイドに向かって往復的に伸び、その後自発的に形成された軸索束である。その結果、2つの皮質スフェロイドを軸索束を介して接続することができ、組織を一片として得ることができる。これは、このアプローチが神経細胞タイプに関係なく軸索束組織を形成する汎用性が高いということを示している。このプロトコルでは、ヒトiPS細胞を用いたが、ヒトES細胞およびヒト神経幹細胞を含む他の幹細胞は、提示されたプロトコルに対する改変とともに使用され得る。ニューロンの3Dスフェロイドは、多様なプロトコル19、20によって生成することができる。軸索束を用いて組織を作るこの方法は、将来的に3D MNスフェロイドを作るための他の分化プロトコルと組み合わせることができる。さらに、軸索バンドルの厚さと長さは、将来の発展のために組織培養チップのマイクロチャネルの幅と高さを単に変更することによって制御することができます。
このプロトコルは、薬物検査やスクリーニングに使用でき、軸索の発達と疾患の根底にあるメカニズムの理解に貢献できると考えています。

脊髄運動ニューロン(MN)は、体の動きを制御するために骨格筋に軸索を拡張します。彼らの軸索軌道は、発達過程において高度に組織化され、規制されている。軸索拡張とガイダンス1に関する多くの研究にもかかわらず、組織化された軸索束形成のためのメカニズムはまだ調査中である。運動ニューロンの軸索は筋萎縮性側索硬化症(ALS)2などの神経変性疾患によって損傷を受けることが多いが、軸膜の損傷の病態生理学的メカニズムは十分に理解されていない。したがって、軸索束の形成と回帰を再現する生理学的および病理学的モデルが現場で必要とされている。
ヒト幹細胞由来運動ニューロンは、ALS 3などの発症や疾患を理解するための有望なプラットフォームである。ヒト誘導多能性幹細胞(iPS細胞)は、患者由来細胞を用いた疾患のモデル化に使用できる。現在までに、多能性幹細胞からMNへの種々の分化方法が4,5,6に報告されている。しかしながら、二次元培養におけるニューロンの軸索はランダムに配向しており、緻密なアキソ軸索相互作用を介して一方向に組み立てられる神経の中で生体内微小環境を再現しない。この問題を克服するために、ヒトiPS細胞8から運動神経に似た三次元組織を生成する技術を開発し、その組織を運動神経オルガノイド(MNO)と名付けました。MNOは、運動ニューロンスフェロイド(MNS)に位置する細胞体と、スフェロイドから伸びた軸索の魅惑から構成されています。ファシクルの軸索は一方向に向き、運動神経の発達における軸索に似ている。したがって、MNは独特に生理学的軸索微小環境を提供し、これは他の以前に開発された神経培養法では行われなかった。
本プロトコルでは、開発されたチップにおける組織培養チップの製造方法、急速運動ニューロン分化、運動神経オルガノイド形成の方法について述べている。当社の組織培養チップは非常にシンプルで、スフェロイドを受け入れるためのコンパートメント、軸索束を形成するためのマイクロチャネル、およびハウジング軸索端子用のコンパートメントのみが含まれています。デバイスには、サイズ9,10で軸索と細胞体を分離するためによく使用されるマイクログルーブやマイクロポアフィルタを含む複雑な構造は含まれていません。したがって、フォトリソグラフィのセットアップが利用可能な場合、このプロトコルで説明されている手順に従うことによって、当社のデバイスを簡単に製造することができます。
ヒトiPS細胞の急速な分化は、誘導およびパターン化因子(SB431542、LDN-193189、レチノイン酸(RA)、および平滑化アゴニスト(SAG))および加速因子(SU5402およびDAPT)の最適化された組み合わせで達成される。SU5402とDAPTの組み合わせにより、末梢ニューロンと神経堤細胞11の分化が加速することが報告されている。このプロトコルでは、MMOを生成する3つの異なる方法を提供し、読者が自分のニーズに最も適した方法を決定できるようにします。分化したMNSは組織培養チップに直接移すことができるため、スフェロイド(3D法)を形成した後にヒトiPS細胞の分化を行うことを推奨します。あるいは、ヒトiPS細胞は、単層(2D)培養において運動ニューロンに分化され、その後、我々が先に報告した8のように三次元運動ニューロン回転楕円体に作り出すことができる。プロトコルを更新し、このプロトコルで説明した三次元分化法により、2Dから3Dへの移行を回避し、MMOは解離ステップなしでより短い分化時間、より少ないステップ、および技術的リスクの低減で得ることができる。市販のニューロンは、分化のための時間を短縮するためにMNSを生成するために使用することもできる。
MNOを生成するために、組織培養チップでMNSを培養した。軸索は回転楕円体から伸び、軸索が集まって一方向に整列するマイクロチャネルに伸びる。これは、このプロトコルによって独自に達成されるマイクロチャネルにおける軸索の緊密に組み立てられた単一方向バンドル組織のアキソ軸索相互作用および自発的な形成を促進するが、自発的な束形成または導かれた軸索方向は、他のプロトコル12、13、14によって単独で達成することができる。典型的な実験では、少数の細胞がスフェロイドからマイクロチャネルに移行し、ほとんどの細胞は近くのスフェロイドにとどまります。この方法により、軸索をサイズ依存の物理的障壁(マイクログルーブやマイクロポアフィルタなど)を使用せずに、軸索を回転楕円体から自発的に分離して、軸索を細胞体から分離することができます。
結果として得られるMNOは形態学的、生化学的および物理的な分析を含むさまざまな検査を受けることができる。細胞体と拡張軸索束は切断によって物理的に単離することができ、下流の実験、例えば生化学的アッセイのために別々に分析することができる。RNAやタンパク質を含む生物学的材料は、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングを含む通常の生化学的アッセイのためのほんの数個の軸索束から単離することができる。ここでは、軸索の発達と疾患のメカニズムを研究するための魅力的な生理学的および病理学的モデルを提供するiPS細胞から運動神経オルガノイドを生成するためのプロトコルについて述べる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

軸索の魅力は、神経系で観察される主要な構造モチーフの一つです。軸索のファシクルの破壊は、発達および神経変性疾患を引き起こす可能性があります。軸索の研究は数多く行われてきましたが、軸索の形成と機能不全の理解は、堅牢な3次元インビトロモデルの欠如のために依然として限られています。ここでは、マイクロ流体ベースの組織培養チップにおけるヒト人工多能性幹細胞(iPS)細胞からの運動神経オルガノイド(MNO)の迅速な生成のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。まず、この方法に用いるチップの製造について説明する。ヒトiPS細胞から、運動ニューロンスフェロイド(MNS)が形成される。次に、差別化されたMNSがチップに転送されます。その後、軸索は自発的にスフェロイドから成長し、チップに装備されたマイクロチャネル内の魅惑的に組み立てられ、スフェロイドから伸びる軸索の束を運ぶMNO組織を生成する。下流の分析のために、MMOは、形態学的分析のために固定されるか、生化学的分析のために解剖されるチップから取り出すことができるだけでなく、カルシウムイメージングおよび多電極アレイの記録。このプロトコルで生成されたMNは、薬物検査とスクリーニングを容易にし、軸索のファシクルの発症および疾患の根底にあるメカニズムの理解に貢献することができます。

運動ニューロンは、3D分化手順で12〜14日以内に分化した(図4および図5)。重要なことに、細胞の60%以上が分化中に運動ニューロンマーカーHB9を発現した。免疫細胞化学は、MNSの細胞の約80%がSMI32陽性運動ニューロンであることを明らかにした。HB9およびSMI32は、確立された初期段階の運動ニューロンマーカー15、16である。HB9およびSMI32の発現は、運動ニューロンの細胞の同一性を確保するために確認する必要がある重要なパラメータである。MNSを培養チップに導入した後、軸索はチャネルに伸び、軸索束が形成されます。物理ガイドとして機能するマイクロチャネルにより、軸索はMNSから伸び、アキソ軸索相互作用によってバンドルを形成する(図6A)。MNOの生成を確認するために顕微鏡観察によって軸索束の形成を確認することが不可欠である。成功したMNOは、50 μmより広い軸索バンドルを、チャネル内のバンドルから少数の孤立した軸索を負担します。軸索の初期伸びは、スフェロイドの導入後24時間で観察することができる。次の3〜4日以内に、軸索はマイクロチャネルの中心に達し、さらに10日以内にもう一方の端まで到達する(図6A)。その結果、軸索は、2〜3週間で一方向のまっすぐな束を組み立てて形成し、その後神経活動が観察された。
運動神経オルガノイドは、生体解析のために顕微鏡ガラスからPDMSを取り外すことによってチップから収集することができる(図6B)。軸索束および細胞体は、顕微鏡下で外科用ナイフまたはツイーザーを用いて切断することによって解剖および単離することができる(図6B)。RNAやタンパク質を含むこれらの生物学的材料は、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングなどの通常の生化学的アッセイに使用することができます。MNの軸索束では、核または樹状のメーカーのタンパク質はウェスタンブロッティングでは検出されない(図6C)。
カルシウムインジケーター(Fluo-4 AM)と組み合わせて、神経細胞活性を組織培養チップに捕捉することができる。MNO内では、回転楕円体および軸索束中の運動ニューロンの自発的な活動が観察された。また、多電極アレイシステムを用いて神経活動を観察した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> 図1:PDMS組織培養チップの寸法。 (A)組織培養チップのフォトマスク。(B)組織培養チップ中のマイクロチャネルの寸法。運動ニューロンスフェロイドを保持するためのベースチャンバーの直径は2mmであり、チャンバー上のPDMSの穴は1.5mmである。マイクロチャネルブリッジ2室の幅と高さは、どちらも150 μmです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> 図2:運動ニューロン分化の模式図。 (A)分化ステップには、神経誘導、運動ニューロン系統へのパターニング、および運動ニューロンの成熟が含まれる。(B) iPS細胞から運動ニューロンスフェロイド(MNS)を作成する2つのオプション:3Dプロトコルと、運動ニューロンの解離ステップを持つ2Dプロトコル。運動神経オルガノイド(MNO)は、両方のプロトコルによって得ることができる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> 図3:基体膜マトリックスコーティングと運動ニューロン回転楕円体導入のためのステップバイステッププロトコル。 (A)組織培養チップのチャネルにおける基質膜マトリックスコーティング。(B)チップの穴に MNS を導入します。(C)培地を吸引して培地を吸引して培地を変化する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> 図4:2Dおよび3D運動ニューロン分化。 (A)代表的な3D MNS分化(3Dプロトコル)の時間経過。MNSのサイズは徐々に増加した。スケールバー:500 μm。(B) -D2、D0、D1、D6、D12 (2D プロトコル) での 2D 分化の時間経過。スケールバー:500 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> 図5:運動ニューロンの特性 (A)(左) SMI-32抗体とDAPIで染色されたMNSのクライオセクション。(中央)基部膜マトリックスコーティングされた表面上の再めっきされたMNSの位相コントラスト画像。軸索伸びが認められた。(右)シナプシンIおよびTuj1抗体で染色された再めっきMNSの軸索。スケールバー:500μm(左と中央)と50μm(右)。(B)TujおよびHB9抗体で免疫染色された2D運動ニューロンの代表的な画像。スケールバー:200 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> 図6:培養チップで発生する運動神経オルガノイド(MNO)の特性評価。 (A)D32上の軸索伸長と厚い軸索束形成の代表的な画像。スケールバー:500 μm。(B) SMI-32及びDAPIによる運動神経オルガノイド(MNO)の免疫染色軸索および細胞体は物理的に切断することによって隔離することができる。スケールバー:1mm(C)ウェスタンブロッティングによって定量された軸索および細胞体からのタンパク質の純度。樹状マーカーであるMAP2は軸索タンパク質では検出されなかったのに対し、軸索マーカーTau1は軸索タンパク質中に富化した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

このプロトコルは、組織培養チップ内のスフェロイドから伸びる強い軸索束の自発的な組み立てを通じて、ヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドを作製するための包括的な手順を提供する。

三次元運動神経オルガノイド発生

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K ビュー.  The University of Tokyo. このプロトコルは、組織培養チップ内のスフェロイドから伸びる強い軸索束の自発的な組み立てを通じて、ヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドを作製するための包括的な手順を提供する。

ビデオ: Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

神経科学

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

再考された補助的なモータ領域のファイバ接続：ファイバ解剖、DTI、および3次元文書の方法論

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

神経フリーの生成と長期維持<em&gt;ヒドラ</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

脳構造の3次元形状モデリングと解析

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

坐骨神経クラッシュ損傷のラットモデルにおける機能的評価のための3D運動学的解析

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

体外における感覚神経と運動神経からの線維芽細胞およびシュワン細胞の精製

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...