Cette étude a été soutenue par la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 et 18K19903, Core-2-core program, et Beyond AI institute.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

Dans le cadre de ce protocole, un brevet a été autorisé à Jiksak Bioengineering, Inc. qui a été fondée par Jiro Kawada.

Ce protocole décrit la formation d’un organoïde de nerf moteur (MNO) qui a un faisceau d’axone étendu à partir d’un sphéroïde de neurone moteur généré à partir des cellules humaines d’iPS. Le faisceau d’axons formé est épais, flexible et bien organisé dans les structures unidirectionnelles. En disséquant le faisceau d’axones, la protéine axonale et l’ARN de haute pureté peuvent être obtenus suffisamment pour des analyses biochimiques. L’activité neuronale peut être mesurée en faisceaux d’axone et en sphéroïdes avec imagerie calcique. La contamination des protéines nucléaires et dendritiques dans le lysate axonal n’a pas été détectée par le ballonnement occidental, démontrant que notre méthode séparait efficacement les axones des corps cellulaires et des dendrites.
Un des avantages de ce protocole est la différenciation rapide et la génération de MNO équipé d’un faisceau d’axons, dans lequel tous les processus peuvent être effectués en 4 semaines avec le protocole 3D et 5-6 semaines en utilisant le protocole 2D. Ceci est court par rapport à d’autres protocoles qui prennent généralement 3-4 semaines pour simplement différencier en MN des cellules souches embryonnaires et des cellules iPS17 et il faut 2-4 semaines supplémentaires pour obtenir l’allongement axonal. Le protocole 3D est généralement préféré au protocole 2D en raison du temps de différenciation plus court, de la diminution des étapes et de la réduction des risques techniques sans l’étape de dissociation par rapport au protocole 2D. La puce de culture tissulaire microfluidique a été conçue de manière à ce que les axones de MNS puissent s’allonger vers l’autre compartiment par le microcanal, ce qui facilite la formation d’un faisceau d’axones en induisant des interactions axo-axonales et des affinités entre les axones. En raison de la simple mise en place expérimentale, tous les protocoles décrits ici peuvent non seulement être exécutés par des bioingénieurs, qui sont familiers avec la manipulation d’une puce de culture tissulaire, mais aussi des biologistes et des neuroscientifiques qui ne sont pas familiers avec les microfluidiques et les techniques de microfabrication. Il convient de noter que les étapes 1 et 2 peuvent également être effectuées à l’aide d’un service de fabrication externe.
Une des étapes critiques pour accomplir le protocole est un changement séquentiel de milieu culturel. Il est conseillé de changer complètement le milieu de culture à chaque étape de la différenciation afin que les facteurs dans le milieu dépensé ne perturbent pas la différenciation MN. Un autre point critique de ce protocole est de maintenir les cellules iPS indifférenciées de bonne qualité. La qualité de la culture cellulaire iPS initiale affecte considérablement l’efficacité d’obtenir des neurones moteurs et MNO. Un autre point est que le diamètre du MNS doit être plus petit que la taille du trou de la puce (1,5 mm). Les sphéroïdes plus grands ne peuvent pas entrer dans la chambre, et éprouvent potentiellement la nécrose hypoxique grave dans la partie centrale. La taille des MNS peut être contrôlée en modifiant un nombre initial d’ensemencement de cellules iPS (en protocole 3D) ou de neurones moteurs (en protocole 2D). La densité d’ensemencement des cellules doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire iPS.
Des dispositifs microfluidiques compartimentés avec des microgrooves et de petits filtres à pores ont été largement utilisés pour séparer les axones des corps cellulaires et des dendrites. Cette technique peut également séparer les axones des corps cellulaires et le dendrite, avec une abondance supérieure d’axones dans les tissus groupés. Par rapport aux autres méthodes, une limitation majeure de cette méthode est qu’elle ne peut pas séparer deux médias culturels différents dans la conception actuelle de la puce de culture tissulaire, ce qui entrave la capacité de co-culture de deux cellules différentes qui nécessitent deux médias distincts. Une autre limitation est que la puce PDMS mis restriction prédéterminée sur la taille du tissu. Un sphéroïde plus grand que le trou ne peut pas entrer dans la chambre, et le faisceau d’axons ne peut pas devenir plus épais que la largeur du canal microfluidique.
Cette méthode peut être appliquée à d’autres types de neurones. Notre groupe a montré la capacité de modéliser un tractus cérébral en utilisant une méthode modifiée combinée avec des techniques organoïdescérébrales 18. Des sphéroïdes corticals ont été introduits dans les deux compartiments et les axones se sont spontanément allongés réciproquement vers chaque sphéroïde, et plus tard un faisceau d’axon s’est formé spontanément. En conséquence, deux sphéroïdes corticals peuvent être reliés par un faisceau d’axons, et le tissu pourrait être obtenu comme une seule pièce. Ceci démontre que l’approche est fortement polyvalente pour former des tissus de faisceau d’axone indépendamment des types neuronaux de cellules. Dans ce protocole, les cellules humaines d’iPS ont été employées, cependant, d’autres cellules souches comprenant les cellules humaines d’ES et les cellules souches neurales humaines peuvent être employées avec des modifications au protocole présenté. Les sphéroïdes 3D des neurones peuvent être générés par divers protocoles19,20. Cette méthode de fabrication de tissus avec un faisceau d’axons peut potentiellement être combinée à l’avenir avec les autres protocoles de différenciation pour la fabrication de sphéroïdes MN 3D. En outre, l’épaisseur et la longueur du faisceau d’axons peuvent être contrôlées en changeant simplement la largeur et la hauteur des microcanaux de la puce de culture tissulaire pour les développements futurs.
Nous croyons que ce protocole peut être utilisé pour le dépistage et le dépistage des drogues et peut contribuer à la compréhension des mécanismes sous-jacents au développement et aux maladies des fascicles d’axon.

Les neurones moteurs rachidiens (MN) étendent les axones aux muscles squelettiques pour contrôler le mouvement du corps. Leurs trajectoires axonales sont très organisées et réglementées dans le processus de développement. En dépit de beaucoup d’études sur l’extension d’axon et laconduite 1,des mécanismes pour la formation organisée de faisceau d’axon sont toujours à l’étude. Les axones des motoneurones sont souvent endommagés par des maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA)2, mais les mécanismes pathophysiologiques des dommages sur les fascicles d’axone sont mal compris. Ainsi, un modèle physiologique et pathologique pour récapituler la formation et la régression des faisceaux d’axons est nécessaire sur le terrain.
Un neurone moteur dérivé de cellules souches humaines est une plate-forme prometteuse pour comprendre le développement et les maladies telles que laSLA 3. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (cellules iPS) peuvent être utilisées pour modéliser les maladies à l’aide de cellules dérivées du patient. À ce jour, diverses méthodes de différenciation des cellules souches pluripotentes en MN ont étésignalées 4,5,6. Cependant, les axones des neurones dans la culture bidimensionnelle sont aléatoirement orientés et ne récapitulent pas le microenvironnement in vivo dans les nerfs en développement dans lesquels les axones sont unidirectionnelment assemblés par des interactions axo-axonales denses7. Pour surmonter ce problème, nous avons développé une technique pour générer un tissu tridimensionnel ressemblant au nerf moteur des cellules humaines d’iPS8,et avons nommé le tissu comme organoïde de nerf moteur (MNO). Le MNO se compose de corps cellulaires situés dans un sphéroïde de neurone moteur (MNS) et d’un fascicle axonal étendu hors du sphéroïde. Les axones du fascicle sont orientés de façon unidirectionnelle, ce qui ressemble à des axones dans le développement des nerfs moteurs. Par conséquent, les MNOs fournissent uniquement un microenvironnement axonal physiologique, qui n’a pas été fait par d’autres méthodes précédemment développées de culture neuronale.
Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour la fabrication de puces de culture de tissu, la différenciation rapide de neurone moteur, et la formation organoïde de nerf moteur dans les puces développées. Notre puce de culture tissulaire est très simple, et elle ne contient qu’un compartiment pour accepter un sphéroïde, un microcanal pour former un faisceau d’axons, et un compartiment pour loger les terminaux axons. L’appareil ne contient pas de structures complexes, y compris des microgrooves ou des filtres micropore qui sont souvent utilisés pour séparer les axones et les corps cellulaires partaille 9,10. Par conséquent, nos appareils peuvent être facilement fabriqués en suivant les étapes décrites dans ce protocole si une configuration de photolithographie est disponible.
La différenciation rapide des cellules iPS humaines est obtenue grâce à une combinaison optimisée de facteurs d’induction et de modelage (SB431542, LDN-193189, acide rétinoïque (RA) et de facteurs agonistes lissés (SAG)) et d’accélération (SU5402 et DAPT). Il a été rapporté que la combinaison de SU5402 et DAPT accélère la différenciation des neurones périphériques et des cellules de crêteneurale 11. Dans ce protocole, nous offrons trois méthodes différentes pour générer des MNOs, afin que les lecteurs puissent décider d’une méthode la plus adaptée à leurs besoins. Nous recommandons d’effectuer la différenciation des cellules iPS humaines après la formation d’un sphéroïde (la méthode 3D), puisque le MNS différencié peut être transféré directement dans une puce de culture tissulaire. Alternativement, les cellules iPS humaines peuvent être différenciées en neurones moteurs dans la culture monocouche (2D), puis créées en sphéroïdes tridimensionnels de neurone moteur comme nous l’avonsprécédemment rapporté 8. Nous avons mis à jour le protocole, et avec la méthode de différenciation tridimensionnelle décrite dans ce protocole, la transition de la 2D à la 3D peut être évitée et les MNOs peuvent être obtenus avec un temps de différenciation plus court, moins d’étapes et des risques techniques réduits sans l’étape de dissociation. Les neurones disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés pour générer du MNS afin de réduire le temps de différenciation.
Pour générer un MNO, nous avons cultivé un MNS dans la puce de culture tissulaire. Les axones s’allongent du sphéroïde et s’étendent dans le microcanal dans lequel les axones se rassemblent et s’alignent unidirectionnellement. Ceci facilite l’interaction axo-axonal et la formation spontanée d’un tissu unidirectionnel étroitement assemblé de faisceau des axones dans le microcanal, qui est particulièrement réalisé par ce protocole, alors que la formation spontanée de faisceau ou l’orientation axonale guidée seule peut être réaliséepar d’autres protocoles 12,13,14. Dans une expérience typique, peu de cellules migrent des sphéroïdes vers le microcanal et la plupart des cellules restent à proximité des sphéroïdes. Cette méthode permet aux axones d’être séparés spontanément des sphéroïdes sans utiliser de barrières physiques dépendantes de la taille (p. ex., microgrooves ou filtres à micropore) pour séparer les axones des corps cellulaires.
Le MNO qui en résulte peut faire l’objet de divers examens, y compris des analyses morphologiques, biochimiques et physiques. Le corps cellulaire et le faisceau étendu d’axons peuvent être physiquement isolés en coupant et peuvent être analysés séparément pour des expériences en aval, par exemple, des analyses biochimiques. Les matériaux biologiques, y compris l’ARN et les protéines, peuvent être isolés de quelques faisceaux d’axons pour des analyses biochimiques régulières, y compris la RT-PCR et le ballonnement occidental. Ici, nous décrivons un protocole pour générer des organoïdes de nerf moteur des cellules d’iPS, qui offre un modèle physiologique et pathologique attrayant pour étudier le mécanisme sous-jacent au développement et à la maladie des fascicles d’axon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Un fascicle d’axones est l’un des principaux motifs structurels observés dans le système nerveux. La perturbation des fascicles d’axon pourrait causer des maladies développementales et neurodégénératives. Bien que de nombreuses études d’axones aient été menées, notre compréhension de la formation et du dysfonctionnement des fascicles d’axon est encore limitée en raison de l’absence de modèles in vitro tridimensionnels robustes. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour la génération rapide d’un organoïde de nerf moteur (MNO) des cellules pluripotentes induites par l’homme de tige (iPS) dans une puce microfluidique de culture de tissu. Tout d’abord, la fabrication des puces utilisées pour la méthode est décrite. À partir de cellules iPS humaines, un sphéroïde de neurone moteur (MNS) est formé. Ensuite, le MNS différencié est transféré dans la puce. Par la suite, les axones se développent spontanément à partir du sphéroïde et s’assemblent en un fascicle dans un microcanal équipé de la puce, qui génère un tissu MNO transportant un faisceau d’axones étendus à partir du sphéroïde. Pour l’analyse en aval, les ONM peuvent être retirés de la puce pour être fixés pour des analyses morphologiques ou disséqués pour des analyses biochimiques, ainsi que pour l’imagerie calcique et les enregistrements de réseaux d’électrodes multiples. Les ONN générés par ce protocole peuvent faciliter le dépistage et le dépistage des drogues et contribuer à la compréhension des mécanismes sous-jacents au développement et aux maladies des fascicles d’axon.

Les neurones moteurs ont été différenciés dans les 12 à 14 jours dans les procédures de différenciation 3D (figure 4 et figure 5). Fait important, plus de 60% des cellules ont exprimé le marqueur de neurone moteur HB9 pendant la différenciation. L’immunohistochimie a indiqué qu’approximativement 80% des cellules dans le MNS étaient des neurones moteurs SMI32-positifs. HB9 et SMI32 sont les marqueurs établis de neurones moteurs à un stadeprécoce 15,16. L’expression de HB9 et SMI32 sont les paramètres clés qui doivent être confirmés pour assurer l’identité cellulaire des neurones moteurs. Après l’introduction d’un MNS dans la puce de culture, les axones s’étendent dans le canal et un faisceau d’axons se forme. En raison de microcanaux servant de guides physiques, les axones s’allongent du MNS et forment un faisceau par interaction axo-axonale (Figure 6A). Il est essentiel de confirmer la formation du faisceau d’axons par observation microscopique pour confirmer la génération d’un MNO. Un MNO réussi porte un faisceau d’axons plus large que 50 μm et peu d’axones isolés hors du faisceau dans le canal. L’allongement initial des axones peut être observé 24 heures après l’introduction du sphéroïde. Dans les 3 à 4 jours suivants, les axones ont atteint le centre du microcanal, puis atteignent l’autre extrémité dans un délai supplémentaire de 10 jours (figure 6A). Par conséquent, les axones se sont assemblés et ont formé un faisceau droit et unidirectionnel en 2-3 semaines dans une puce, et des activités neuronales ont été observées par la suite.
Les organoïdes nerveux moteurs peuvent être prélevés sur la puce en détachant le PDMS du verre microscope pour analyse biologique (figure 6B). Les faisceaux d’axoons et les corps cellulaires peuvent être disséqués et isolés en coupant à l’aide d’un couteau chirurgical ou d’une pince à épiler au microscope (figure 6B). Ces matériaux biologiques, y compris l’ARN et les protéines, peuvent être utilisés pour des analyses biochimiques régulières telles que la RT-PCR et le ballonnement occidental. Dans les faisceaux d’axons d’ONN, les protéines nucléaires ou dendritiques ne sont pas détectées dans les ballonnements occidentaux (figure 6C).
En combinaison avec un indicateur de calcium (Fluo-4 AM), l’activité neuronale peut être capturée dans la puce de culture tissulaire. L’activité spontanée des neurones moteurs dans le sphéroïde et le faisceau d’axone ont été observées dans le MNO. En outre, les activités neuronales ont été observées à l’aide d’un système de réseau multi-électrodes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figure 1 : La dimension de la puce de culture tissulaire PDMS. (A) Photomask de la puce de culture tissulaire. (B) Dimensions du microcanal dans la puce de culture tissulaire. Le diamètre de la chambre de base pour tenir le sphéroïde de neurone moteur est de 2 mm et le trou de PDMS au-dessus de la chambre est de 1,5 mm. La largeur et la hauteur d’un microcanal faisant le pont entre deux chambres sont toutes deux de 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figure 2 : Illustration schématique de la différenciation des neurones moteurs. (A) Les étapes de différenciation ont impliqué l’induction neuronale, le modelage dans la lignée de neurone moteur, et la maturation des neurones moteurs. (B) Deux options pour créer des sphéroïdes neurones moteurs (MNS) à partir de cellules iPS: protocole 3D, et un protocole 2D avec étape de dissociation des neurones moteurs. Organoïde nerveux moteur (MNO) peut être obtenu par les deux protocoles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figure 3 : Protocole étape par étape pour le revêtement matriciel membranaire du sous-sol et l’introduction sphéroïde des neurones moteurs. (A) Revêtement matricielle membranaire du sous-sol dans le canal de la puce de culture tissulaire. (B) Introduction MNS dans le trou de la puce. (C) Changement de milieu culturel par aspiration de médium épuisé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figure 4 : Différenciation des neurones moteurs 2D et 3D. (A) Cours du temps de différenciation représentative 3D MNS (protocole 3D). La taille du MNS a progressivement augmenté au fil du temps. Barre d’échelle : 500 μm. (B) Cours du temps de différenciation 2D sur -D2, D0, D1, D6, D12 (protocole 2D). Barre d’échelle : 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figure 5 : Caractérisation des motoneurones. (A) (Gauche) Une cryosection d’un MNS taché d’anticorps SMI-32 et de DAPI. (Milieu) Une image de contraste de phase de MNS replaqué sur une surface matricielle de membrane de sous-sol- enduite. L’allongement axonal a été observé. (Droite) Axones de MNS replaqué souillés avec des anticorps Synapsin I et Tuj1. Barre d’échelle : 500 μm (gauche et milieu) et 50μm (droite). (B) Une image représentative des neurones moteurs 2D immunotachés avec des anticorps Tuj et HB9. Barre d’échelle : 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figure 6 : Caractérisation d’un organoïde nerveux moteur (MNO) généré dans une puce de culture. (A) Images représentatives de l’allongement de l’axon et de la formation épaisse de faisceaux d’axons sur D32. Barre d’échelle : 500 μm. (B) Immunostaining de l’organoïde de nerf moteur (MNO) par SMI-32 et DAPI. Les axones et les corps cellulaires peuvent être isolés en coupant physiquement. Barre d’échelle : 1 mm. (C) Pureté de la protéine des axones et des corps cellulaires quantifiés par ballonnement occidental. MAP2, un marqueur dendritique, n’a pas été détecté dans la protéine axonale, tandis que le marqueur axonal Tau1 est enrichi en protéine axonale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Ce protocole fournit une procédure complète pour fabriquer l’organoïde humain de nerf moteur iPS cellule-dérivée par l’assemblage spontané d’un faisceau robuste d’axones étendus d’un sphéroïde dans une puce de culture de tissu.

Génération organoïde tridimensionnelle de nerf moteur

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K vues.  The University of Tokyo. Ce protocole fournit une procédure complète pour fabriquer l’organoïde humain de nerf moteur iPS cellule-dérivée par l’assemblage spontané d’un faisceau robuste d’axones étendus d’un sphéroïde dans une puce de culture de tissu.

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Recherche

Neurosciences

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocole pour tridimensionnelle confocale Analyse morphométrique des astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Imagerie en trois dimensions et l’analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses humaines intra-épidermiques

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

Connexions à la fibre de la zone de moteur supplémentaire revisitée: Méthodologie de la dissémination des fibres, de la DTI et de la documentation tridimensionnelle

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Génération et entretien à long terme sans nerve<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Imagerie tridimensionnelle à grande échelle de l’organisation cellulaire dans le néocortex de souris

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Modélisation et analyse tridimensionnelles de la forme des structures cérébrales

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analyse cinématique 3D pour l’évaluation fonctionnelle dans le modèle de rat de la blessure d’écrasement de nerf sciatique

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purification des fibroblastes et des cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...