Questo studio è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 e 18K19903, dal programma Core-2-core e dall'istituto Beyond AI.

<ol>
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G. M., Kamm, R. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

In parte di questo protocollo, un brevetto è stato concesso in licenza a Jiksak Bioengineering, Inc.

Questo protocollo descrive la formazione di un organoide del nervo motorio (MNO) che ha un fascio di assoni esteso da uno sferoide del motoneurone generato da cellule iPS umane. Il fascio di assoni formato è spesso, flessibile e ben organizzato in strutture unidirezionali. Sezionando il fascio di assoni, la proteina assonale ad alta purezza e l'RNA possono essere ottenuti a sufficienza per le analisi biochimiche. L'attività neuronale può essere misurata in fasci di assioni e sferoidi con imaging del calcio. La contaminazione delle proteine nucleari e dendritiche nel lisato assonale non è stata rilevata dall'assorbimento occidentale, dimostrando che il nostro metodo separava efficacemente gli assoni dai corpi cellulari e dai dendriti.
Uno dei vantaggi di questo protocollo è la rapida differenziazione e generazione di MNO dotato di un bundle axon, in cui tutti i processi possono essere eseguiti in 4 settimane con il protocollo 3D e 5-6 settimane utilizzando il protocollo 2D. Questo è breve rispetto ad altri protocolli che in genere richiedono 3-4 settimane per differenziarsi semplicemente in MN dalle cellule staminali embrionali e dalle cellule iPS17 e ci vogliono altre 2-4 settimane per ottenere l'allungamento assonale. Il protocollo 3D è generalmente preferito rispetto al protocollo 2D a causa del tempo di differenziazione più breve, meno passaggi e rischi tecnici ridotti senza il passaggio di dissociazione rispetto al protocollo 2D. Il chip di coltura tissutale a base microfluidica è stato progettato in modo che gli assoni di MNS possano allungarsi verso l'altro compartimento attraverso il microcanale, il che facilita la formazione di un fascio di assoni inducendo interazioni asso-assonali e affinità tra assoni. A causa del semplice set-up sperimentale, tutti i protocolli qui descritti possono essere eseguiti non solo dai bioingegneri, che hanno familiarità con la manipolazione di un chip di coltura tissutale, ma anche da biologi e neuroscienziati che non hanno familiarità con le tecniche di microfluidica e microfabbricazione. Va notato che i passaggi 1 e 2 possono essere eseguiti anche utilizzando un servizio di fabbricazione esterno.
Uno dei passaggi critici per realizzare il protocollo è un cambiamento sequenziale del mezzo di coltura. Si consiglia di cambiare completamente il mezzo di coltura ad ogni fase durante la differenziazione in modo che i fattori nel mezzo speso non disturbino la differenziazione MN. Un altro punto critico di questo protocollo è mantenere le celle iPS indifferenziate in buona qualità. La qualità della coltura cellulare iPS iniziale influisce significativamente sull'efficienza per ottenere motoneuroni e MNO. Un altro punto è che il diametro di MNS dovrebbe essere inferiore alle dimensioni del foro del truciolo (1,5 mm). Gli sferoidi più grandi non possono entrare nella camera e potenzialmente sperimentano una grave necrosi ipossia nella parte centrale. La dimensione degli MNS può essere controllata modificando un numero iniziale di seeding di cellule iPS (nel protocollo 3D) o motoneuroni (nel protocollo 2D). La densità di semina delle cellule deve essere ottimizzata per ogni linea cellulare iPS.
Dispositivi microfluidici compartimentati con microgroovi e piccoli filtri porosi sono stati ampiamente utilizzati per separare gli assoni dai corpi cellulari e dai dendriti. Questa tecnica può anche separare gli assoni dai corpi cellulari e dalla dendrite, con un'abbondanza superiore di assoni nei tessuti raggruppati. Rispetto agli altri metodi, una delle principali limitazioni di questo metodo è che non può separare due diversi mezzi di coltura nell'attuale progettazione del chip di coltura tissutale, che ostacola la capacità di co-coltura di due cellule diverse che richiedono due mezzi distinti. Un'altra limitazione è che il chip PDMS ha posto restrizioni predeterminate sulle dimensioni del tessuto. Uno sferoide più grande del foro non può entrare nella camera, e il fascio di assoni non può diventare più spesso della larghezza del canale microfluidico.
Questo metodo può essere applicato ad altri tipi di neuroni. Il nostro gruppo ha dimostrato di essere in grado di modellare un tratto cerebrale utilizzando un metodo modificato combinato con le tecniche organoidicerebrali 18. Gli sferoidi corticali furono introdotti in entrambi i compartimenti e gli assoni si allungarono spontaneamente reciprocamente verso ogni sferoide, e successivamente un fascio di assoni si formò spontaneamente. Di conseguenza, due sferoidi corticali possono essere collegati attraverso un fascio di assoni, e il tessuto potrebbe essere ottenuto come un unico pezzo. Ciò dimostra che l'approccio è altamente versatile per formare tessuti a fascio di assoni indipendentemente dai tipi di cellule neuronali. In questo protocollo, le cellule iPS umane sono state utilizzate, tuttavia, altre cellule staminali tra cui cellule ES umane e cellule staminali neurali umane possono essere utilizzate con modifiche al protocollo presentato. Gli sferoidi 3D dei neuroni possono essere generati da diversiprotocolli 19,20. Questo metodo di produzione di tessuti con un fascio di assoni può potenzialmente essere combinato in futuro con gli altri protocolli di differenziazione per la produzione di sferoide MN 3D. Inoltre, lo spessore e la lunghezza del fascio di assoni possono essere controllati semplicemente cambiando la larghezza e l'altezza dei microcanali del chip di coltura tissutale per sviluppi futuri.
Riteniamo che questo protocollo possa essere utilizzato per il test e lo screening dei farmaci e possa contribuire alla comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo e delle malattie dei fascicoli degli assoni.

I motoneuroni spinali (MN) estendono gli assoni ai muscoli scheletrici per controllare il movimento del corpo. Le loro traiettorie assonali sono altamente organizzate e regolate nel processo di sviluppo. Nonostante molti studi sull'estensione e la guidadell'assone 1,i meccanismi per la formazione organizzata di fasci di assione sono ancora in fase di studio. Gli assoni dei motoneuroni sono spesso danneggiati da malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SSN)2, ma i meccanismi fisiopatologici del danno sui fascicoli dell'assone sono poco compresi. Pertanto, è necessario un modello fisiologico e patologico per ricapitolare la formazione e la regressione del fascio di assione nel campo.
Un motoneurone derivato dalle cellule staminali umane è una piattaforma promettente per comprendere lo sviluppo e malattie come la SSA3. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (cellule iPS) possono essere utilizzate per modellare le malattie utilizzando cellule derivate dal paziente. Ad oggi, sono stati riportati vari metodi di differenziazione dalle cellule staminali pluripotenti alla MN4,5,6. Tuttavia, gli assoni di neuroni in coltura bidimensionale sono orientati casualmente e non ricapitolano microambiente in vivo all'interno dei nervi in via di sviluppo in cui gli assoni sono assemblati unidirezionale attraverso dense interazioni assio-assonali7. Per superare questo problema, abbiamo sviluppato una tecnica per generare un tessuto tridimensionale simile al nervo motorio dalle cellule iPS umane 8 eabbiamo chiamatoil tessuto organoide del nervo motorio (MNO). L'MNO è costituito da corpi cellulari situati in uno sferoide del motoneurone (MNS) e un fasclo assonale esteso fuori dallo sferoide. Gli assoni nel fasccolo sono orientati in modo unidirezionale, che assomiglia agli assoni nello sviluppo dei nervi motori. Pertanto, gli MNO forniscono in modo univoco un microambiente assonale fisiologico, che non è stato fatto da altri metodi di coltura neuronale precedentemente sviluppati.
In questo protocollo, descriviamo i metodi per la fabbricazione di chip di coltura tissutale, la rapida differenziazione dei motoneuroni e la formazione organoide del nervo motorio nei chip sviluppati. Il nostro chip di coltura tissutale è molto semplice e contiene solo uno scomparto per accettare uno sferoide, un microcanale per formare un fascio di assoni e uno scomparto per l'alloggiamento dei terminali degli assoni. Il dispositivo non contiene strutture complesse tra cui microgrooves o filtri micropore che vengono spesso utilizzati per separare assoni e corpi cellulari per dimensioni9,10. Quindi i nostri dispositivi possono essere facilmente fabbricati seguendo i passaggi descritti in questo protocollo se è disponibile una configurazione fotolitografica.
La rapida differenziazione delle cellule iPS umane si ottiene con una combinazione ottimizzata di fattori di induzione e patterning (SB431542, LDN-193189, acido retinoico (RA) e agonista levigato (SAG)) e fattori di accelerazione (SU5402 e DAPT). È stato riferito che la combinazione di SU5402 e DAPT accelera la differenziazione dei neuroni periferici e delle cellule della crestaneurale 11. In questo protocollo, offriamo tre diversi metodi per generare MNO, in modo che i lettori possano decidere un metodo più adatto alle loro esigenze. Si consiglia di eseguire la differenziazione delle cellule iPS umane dopo aver formato uno sferoide (il metodo 3D), poiché l'MNS differenziato può essere trasferito direttamente in un chip di coltura tissutale. In alternativa, le cellule iPS umane possono essere differenziate in motoneuroni in coltura monostrato (2D), e quindi create in sferoidi dei motoneuroni tridimensionali come abbiamoprecedentemente riportato 8. Abbiamo aggiornato il protocollo e, con il metodo di differenziazione tridimensionale descritto in questo protocollo, la transizione dal 2D al 3D può essere evitata e gli MNO possono essere ottenuti con tempi di differenziazione più brevi, meno passaggi e rischi tecnici ridotti senza la fase di dissociazione. I neuroni disponibili in commercio possono anche essere utilizzati per generare MNS per ridurre i tempi di differenziazione.
Per generare un MNO, abbiamo coltivato un MNS nel chip di coltura tissutale. Gli assoni si allungano dallo sferoide e si estendono nel microcanale in cui gli assoni si riuniscono e si allineano unidirezionali. Ciò facilita l'interazione asso-assionale e la formazione spontanea di un fascio unidirezionale strettamente assemblato di assoni nel microcanale, che è ottenuto in modo univoco da questo protocollo, mentre la formazione spontanea di fasci o l'orientamento assonale guidato da solo possono essere raggiuntida altri protocolli 12,13,14. In un esperimento tipico, poche cellule migrano dagli sferoidi al microcanale e la maggior parte delle cellule rimane negli sferoidi vicini. Questo metodo permette agli assoni di essere separati spontaneamente dagli sferoidi senza utilizzare barriere fisiche dipendenti dalle dimensioni (ad esempio, microgroovi o filtri a micropore) per separare gli assoni dai corpi cellulari.
L'MNO risultante può essere sottoposto a vari esami, tra cui analisi morfologiche, biochimiche e fisiche. Il corpo cellulare e il fascio esteso di assoni possono essere fisicamente isolati tagliando e possono essere analizzati separatamente per esperimenti a valle, ad esempio test biochimici. I materiali biologici tra cui RNA e proteine possono essere isolati da pochi fasci di assoni per test biochimici regolari tra cui RT-PCR e macchia occidentale. Qui descriviamo un protocollo per generare organoide nervoso motorio dalle cellule iPS, che offre un modello fisiologico e patologico attraente per studiare il meccanismo alla base dello sviluppo e della malattia dei fascicoli assoni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Un fasccle di assoni è uno dei principali motivi strutturali osservati nel sistema nervoso. L'interruzione delle fascole di assone potrebbe causare malattie dello sviluppo e neurodegenerative. Sebbene siano stati condotti numerosi studi sugli assoni, la nostra comprensione della formazione e della disfunzione dei fasccoli assoni è ancora limitata a causa della mancanza di robusti modelli tridimensionali in vitro. Qui descriviamo un protocollo passo-passo per la rapida generazione di un organoide del nervo motorio (MNO) da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPS) in un chip di coltura tissutale a base microfluidica. In primo luogo, viene descritta la fabbricazione di chip utilizzati per il metodo. Dalle cellule iPS umane si forma uno sferoide dei motoneuroni (MNS). Successivamente, l'MNS differenziato viene trasferito nel chip. Successivamente, gli assoni crescono spontaneamente dallo sferoide e si assemblano in un fasclo all'interno di un microcanale equipaggiato nel chip, che genera un tessuto MNO che trasporta un fascio di assoni estesi dallo sferoide. Per l'analisi a valle, gli MNO possono essere prelevati dal chip per essere fissati per analisi morfologiche o sezionati per analisi biochimiche, nonché per l'imaging del calcio e registrazioni di array multi-elettrodi. Gli MNO generati con questo protocollo possono facilitare il test e lo screening dei farmaci e possono contribuire alla comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo e delle malattie dei fascicoli dell'assone.

I motoneuroni sono stati differenziati entro 12-14 giorni nelle procedure di differenziazione 3D (Figura 4 e Figura 5). È importante sottolineare che più del 60% delle cellule ha espresso il marcatore del motoneurone HB9 durante la differenziazione. L'immunoistochimica ha rivelato che circa l'80% delle cellule nell'MNS erano motoneuroni positivi all'SMI32. HB9 e SMI32 sono i marcatori dei motoneuroni in fase inizialestabiliti 15,16. L'espressione di HB9 e SMI32 sono i parametri chiave che devono essere confermati per garantire l'identità cellulare dei motoneuroni. Dopo l'introduzione di un MNS nel chip di coltura, gli assoni si estendono nel canale e si forma un fascio di assoni. A causa dei microcanali che fungono da guide fisiche, gli assoni si allungano dall'MNS e formano un fascio per interazione assio-assionale (Figura 6A). È essenziale confermare la formazione del fascio di assoni mediante osservazione microscopica per confermare la generazione di un MNO. Un MNO di successo porta un fascio di assoni più largo di 50 μm e pochi assoni isolati fuori dal fascio nel canale. L'allungamento iniziale degli assoni può essere osservato 24 ore dopo l'introduzione dello sferoide. Entro i successivi 3-4 giorni, gli assoni raggiunsero il centro del microcanale per poi raggiungere l'altra estremità entro altri 10 giorni(Figura 6A). Di conseguenza, gli assoni si assemblarono e formarono un fascio dritto e unidirezionale in 2-3 settimane in un chip, e le attività neuronali furono osservate in seguito.
Gli organoidi nervosi motori possono essere raccolti dal truciolo staccando il PDMS dal vetro del microscopio per l'analisi biologica (Figura 6B). I fasci di assone e i corpi cellulari possono essere sezionati e isolati tagliando utilizzando un coltello chirurgico o una pinzetta al microscopio (Figura 6B). Questi materiali biologici tra cui RNA e proteine possono essere utilizzati per regolari saggi biochimici come RT-PCR e western blotting. Nei fasci di axon di MNO, le proteine del produttore nucleare o dendritico non vengono rilevate nell'assorbimento occidentale (Figura 6C).
In combinazione con un indicatore di calcio (Fluo-4 AM), l'attività neuronale può essere catturata nel chip di coltura tissutale. L'attività spontanea dei motoneuroni nello sferoide e nel fascio di assoni è stata osservata all'interno dell'MNO. Inoltre, le attività neurali sono state osservate utilizzando un sistema array multi-elettrodo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figura 1: La dimensione del chip di coltura tissutale PDMS. (A) Fotomaschera del chip di coltura tissutale. (B) Dimensioni del microcanale nel chip di coltura tissutale. Il diametro della camera di base per trattenere lo sferoide del motoneurone è di 2 mm e il foro del PDMS sopra la camera è di 1,5 mm. La larghezza e l'altezza di un microcanale che collega due camere sono entrambe di 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figura 2: Illustrazione schematica della differenziazione dei motoneuroni. (A) Le fasi di differenziazione hanno comportato l'induzione neurale, il patterning nel lignaggio dei motoneuroni e la maturazione dei motoneuroni. (B) Due opzioni per creare lo sferoide dei motoneuroni (MNS) dalle cellule iPS: il protocollo 3D e un protocollo 2D con fase di dissociazione dei motoneuroni. L'organoide del nervo motorio (MNO) può essere ottenuto da entrambi i protocolli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figura 3: Protocollo passo dopo passo per il rivestimento della matrice della membrana basale e l'introduzione dello sferoide del motoneurone. (A) Rivestimento a matrice di membrana basale nel canale del chip di coltura tissutale. (B) Introduzione MNS nel foro del truciolo. (C) Variazione media della coltura mediante aspirazione di mezzi esauriti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figura 4: Differenziazione dei motoneuroni 2D e 3D. (A) Corso di tempo di differenziazione rappresentativa 3D MNS (protocollo 3D). Le dimensioni dell'MNS sono gradualmente aumentate nel tempo. Barra di scala: 500 μm. (B) Corso di tempo della differenziazione 2D su -D2, D0, D1, D6, D12 (protocollo 2D). Barra di scala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figura 5: Caratterizzazione dei motoneuroni. (A) (Sinistra) Una criosezione di un MNS macchiato con anticorpo SMI-32 e DAPI. (Al centro) Immagine a contrasto di fase di MNS rilato su una superficie rivestita di matrice a membrana basale. È stato osservato l'allungamento assonale. (A destra) Assoni di MNS pentiti macchiati con anticorpi Synapsin I e Tuj1. Barra di scala: 500 μm (sinistra e centrale) e 50μm (destra). (B) Un'immagine rappresentativa dei motoneuroni 2D immunososteniati con anticorpi Tuj e HB9. Barra di scala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figura 6: Caratterizzazione di un organoide del nervo motorio (MNO) generato in un chip di coltura. (A) Immagini rappresentative dell'allungamento dell'assone e della formazione di fasci di assione spessi su D32. Barra di scala: 500 μm. (B) Immunostaining of motor nerve organoid (MNO) di SMI-32 e DAPI. Assoni e corpi cellulari possono essere isolati tagliando fisicamente. Barra di scala: 1 mm. (C) Purezza della proteina da assoni e corpi cellulari quantificati dall'assorbimento occidentale. MAP2, un marcatore dendritico, non è stato rilevato nella proteina assonale, mentre il marcatore assonale Tau1 è arricchito nella proteina assonale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Questo protocollo fornisce una procedura completa per fabbricare organoide del nervo motorio derivato dalle cellule iPS umane attraverso l'assemblaggio spontaneo di un robusto fascio di assoni estesi da uno sferoide in un chip di coltura tissutale.

Generazione organoide nervosa motoria tridimensionale

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K Views.  The University of Tokyo. Questo protocollo fornisce una procedura completa per fabbricare organoide del nervo motorio derivato dalle cellule iPS umane attraverso l'assemblaggio spontaneo di un robusto fascio di assoni estesi da uno sferoide in un chip di coltura tissutale.

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Ricerca

Neuroscienze

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Imaging tridimensionale e l'analisi dei mitocondri all'interno di fibre nervose umane Intraepidermal

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

Connessioni a fibre della zona motori aggiuntiva Revisited: Metodologia della discizione a fibre, DTI e documentazione tridimensionale

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Generazione e manutenzione a lungo termine di nervi liberi<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Modellazione tridimensionale delle forme e analisi delle strutture cerebrali

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Methods Article

Generazione organoide nervosa motoria tridimensionale