Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği (JSPS) Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibeleri 17H05661 ve 18K19903, Core-2-core programı ve Beyond AI enstitüsü tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

Bu protokolün bir parçası olarak, Jiro Kawada tarafından kurulan Jiksak Bioengineering, Inc.'e bir patent lisanslanmıştır.

Bu protokol, insan iPS hücrelerinden üretilen bir motor nöron küreselden uzatılmış bir akson demetine sahip bir motor sinir organoidinin (MNO) oluşumunu açıklar. Oluşan akson demeti kalın, esnek ve tek yönlü yapılarda iyi organize edilmiş. Akson demetinin diseksiyonu ile biyokimyasal analizler için yüksek saflıkta aksonal protein ve RNA elde edilebilir. Nöronal aktivite kalsiyum görüntüleme ile akson demetleri ve sferoidlerde ölçülebilir. Aksonal lisattaki nükleer ve dendritik proteinlerin kirlenmesi batı şişkinliği ile tespit edilmedi ve yöntemimizin aksonları hücre gövdelerinden ve dendritlerden verimli bir şekilde ayırdığını gösterdi.
Bu protokolün avantajlarından biri, tüm işlemlerin 3D protokol ile 4 haftada ve 2D protokol kullanılarak 5-6 haftada yapılabileceği bir akson demeti ile donatılmış MNO'nun hızlı farklılaşması ve üretilmesidir. Bu, embriyonik kök hücrelerden ve iPS hücrelerinden 17'ye MN'ye ayırt edilmesi tipik olarak3-4 hafta süren diğer protokollere kıyasla kısadır ve aksonal uzama elde etmek 2-4 hafta daha sürer. 3D protokolü, 2D protokolüne kıyasla ayrışma adımı olmadan daha kısa farklılaşma süresi, daha az adım ve azaltılmış teknik riskler nedeniyle genellikle 2D protokole göre tercih edilir. Mikroakışkan tabanlı doku kültürü çipi, MNS'nin aksonlarının mikrokanal aracılığıyla diğer bölmeye doğru uzaması için tasarlanmıştır, bu da aksonlar arasında akson etkileşimleri ve benzeşimi teşvik ederek bir akson demetinin oluşumunu kolaylaştırır. Basit deneysel kurulum nedeniyle, burada açıklanan tüm protokoller sadece bir doku kültürü çipinin manipülasyonuna aşina olan biyomühendisler tarafından değil, aynı zamanda mikroakışkanlara ve mikrofabrikasyon tekniklerine aşina olmayan biyologlar ve sinirbilimciler tarafından da gerçekleştirilebilir. Adım 1 ve 2'nin harici bir imalat hizmeti kullanılarak da gerçekleştirilebileceği unutulmamalıdır.
Protokolü gerçekleştirmek için kritik adımlardan biri, kültür ortamının sıralı bir değişimidir. Harcanan ortamdaki faktörlerin MN farklılaşmasını bozmaması için farklılaşma sırasında her adımda kültür ortamının tamamen değiştirilmesi önerilir. Bu protokolün bir diğer kritik noktası, farklılaşmamış iPS hücrelerini iyi kalitede tutmaktır. İlk iPS hücre kültürünün kalitesi, motor nöronlar ve MNO elde etme verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Başka bir nokta, MNS çapının talaşın deliğinin boyutundan (1,5 mm) daha küçük olması gerektiğidir. Daha büyük küreseller odaya giremez ve potansiyel olarak orta kısımda şiddetli hipoksik nekroz yaşarlar. MNS'lerin boyutu, iPS hücrelerinin (3D protokolde) veya motor nöronların (2D protokolde) ilk tohumlama sayısı değiştirilerek kontrol edilebilir. Hücrelerin tohumlama yoğunluğu her iPS hücre hattı için optimize edilmelidir.
Mikrogroovlar ve küçük gözenek filtreleri ile bölmeli mikroakışkan cihazlar, aksonları hücre gövdelerinden ve dendritlerden ayırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu teknik ayrıca aksonları hücre gövdelerinden ve dendritten ayırabilir, demetlenmiş dokularda üstün akson bolluğu ile. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntemin önemli bir sınırlaması, doku kültürü çipinin mevcut tasarımında iki farklı kültür medyasını ayıramamasıdır, bu da iki farklı ortam gerektiren iki farklı hücrenin ortak kültür yeteneğini engeller. Diğer bir sınırlama, PDMS çipinin dokunun boyutuna önceden belirlenmiş bir kısıtlama koymasıdır. Delikten daha büyük bir küresel odaya giremez ve akson demeti mikroakışkan kanalın genişliğinden daha kalın büyüyemez.
Bu yöntem diğer nöron türlerine de uygulanabilir. Grubumuz serebral organoid teknikleri ile birlikte modifiye bir yöntem kullanarak serebral sistemi modelleme yeteneği göstermiştir18. Kortikal sferoidler her iki bölmeye de sokuldu ve aksonlar her bir küreseloide doğru karşılıklı olarak kendiliğinden uzadı ve daha sonra kendiliğinden bir akson demeti oluştu. Sonuç olarak, iki kortikal sferoid bir akson demeti ile bağlanabilir ve doku tek parça olarak elde edilebilir. Bu, nöronal hücre türlerinden bağımsız olarak akson demet dokuları oluşturmak için yaklaşımın çok yönlü olduğunu göstermektedir. Bu protokolde insan iPS hücreleri kullanılmıştır, ancak sunulan protokolde yapılan değişikliklerle insan ES hücreleri ve insan sinir kök hücreleri de dahil olmak üzere diğer kök hücreler kullanılabilir. Nöronların 3D sferoidleri çeşitli protokoller19,20ile üretilebilir. Bir akson demeti ile doku yapma bu yöntem potansiyel olarak gelecekte 3D MN sferoid yapmak için diğer farklılaşma protokolleri ile kombine edilebilir. Ek olarak, akson demetinin kalınlığı ve uzunluğu, gelecekteki gelişmeler için doku kültürü çipinin mikrokanellerinin genişliği ve yüksekliği değiştirilerek kontrol edilebilir.
Bu protokolün ilaç testi ve taraması için kullanılabileceğine ve akson fasiküllerinin gelişiminin ve hastalıklarının altında kalan mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunabileceğine inanıyoruz.

Spinal motor nöronlar (MN), vücut hareketini kontrol etmek için aksonları iskelet kaslarına uzatır. Aksonal yörüngeleri gelişim sürecinde son derece organize ve düzenlenmiştir. Axon uzatma ve rehberlik1ile ilgili birçok çalışmaya rağmen, organize akson demeti oluşumu için mekanizmalar hala incelenmektedir. Motor nöronların aksonları genellikle amyotrofik lateral skleroz (ALS)2gibi nörodejeneratif hastalıklardan zarar görür, ancak akson fasiküllerindeki hasarın patofizyolojik mekanizmaları iyi anlaşılmaz. Bu nedenle, alanda akson demeti oluşumunu ve gerilemesini rekapitüle etmek için fizyolojik ve patolojik bir model gereklidir.
İnsan kök hücre türevi motor nöron, ALS3gibi gelişimi ve hastalıkları anlamak için umut verici bir platformdur. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPS hücreleri) hasta kaynaklı hücreler kullanılarak hastalıkları modellemek için kullanılabilir. Bugüne kadar pluripotent kök hücrelerden MN'ye çeşitli farklılaşma yöntemleribildirilmiştir 4,5,6. Bununla birlikte, iki boyutlu kültürdeki nöronların aksonları rastgele yönlendirilir ve aksonların yoğun axo-aksonal etkileşimler yoluyla tek yönlü olarak bir araya getirildiği gelişen sinirler içinde in vivo mikroçevriciliği rekapitüle etmez7. Bu sorunun üstesinden gelmek için, insan iPS hücrelerinden motor sinire benzeyen üç boyutlu bir doku oluşturmak için bir teknik geliştirdik8ve dokuyu motor sinir organoidi (MNO) olarak adlandırdık. MNO, bir motor nöron sferoidinde (MNS) bulunan hücre gövdelerinden ve sferoidden uzatılmış bir aksonal fasikülden oluşur. Fasiküldeki aksonlar, motor sinirlerin gelişimindeki aksonlara benzeyen tek yönlüdür. Bu nedenle, MNO'lar benzersiz olarak, daha önce geliştirilen diğer nöronal kültür yöntemleri tarafından yapılmayan fizyolojik bir aksonal mikroçevronment sağlar.
Bu protokolde, geliştirilen çiplerde doku kültürü yongaları imalatı, hızlı motor nöron farklılaşması ve motor sinir organoid oluşumu için yöntemler açıklanmaktadır. Doku kültürü çipimiz çok basittir ve sadece bir küresel kabul etmek için bir bölme, bir akson demeti oluşturmak için bir mikro kanal ve axon terminallerini muhafaza etmek için bir bölme içerir. Cihaz, genellikle aksonları ve hücre gövdelerini9,10boyutuna göre ayırmak için kullanılan mikrogroovlar veya mikropor filtreleri de dahil olmak üzere karmaşık yapılar içermez. Bu nedenle, bir fotolithografi kurulumu mevcutsa, cihazlarımız bu protokolde açıklanan adımları izleyerek kolayca üretilebilir.
İnsan iPS hücrelerinin hızlı farklılaşması, indükleme ve desenleme faktörlerinin (SB431542, LDN-193189, retinoik asit (RA) ve yumuşatılmış agonist (SAG)) ve ivme faktörlerinin (SU5402 ve DAPT) optimize edilmiş bir kombinasyonu ile elde edilir. SU5402 ve DAPT kombinasyonunun periferik nöronların ve nöral kret hücrelerinin farklılaşmasını hızlandırdığı bildirilmiştir11. Bu protokolde, okuyucuların ihtiyaçlarına en uygun bir yönteme karar verebilmeleri için MNO'lar oluşturmak için üç farklı yöntem sunuyoruz. Farklılaştırılmış MNS doğrudan bir doku kültürü çipine aktarılabildiğinden, bir küresel (3D yöntem) oluşturduktan sonra insan iPS hücrelerinin farklılaştırılmasını öneririz. Alternatif olarak, insan iPS hücreleri monolayer (2D) kültüründe motor nöronlara ayırt edilebilir ve daha önce bildirdiğimiz gibi üç boyutlu motor nöron küresellere oluşturulabilir8. Protokolü güncelledik ve bu protokolde açıklanan üç boyutlu farklılaşma yöntemi ile 2D'den 3D'ye geçiş önlenebilir ve MNO'lar ayrışma adımı olmadan daha kısa farklılaşma süresi, daha az adım ve azaltılmış teknik risklerle elde edilebilir. Piyasada bulunan nöronlar, farklılaşma süresini azaltmak için MNS üretmek için de kullanılabilir.
Bir MNO oluşturmak için, doku kültürü çipinde bir MNS kültürü yaptık. Aksonlar küreselden uzaklaşır ve aksonların tek yönlü olarak toplandığı ve hizalandığı mikro kanala uzanır. Bu, mikrokanalde sıkıca monte edilmiş tek yönlü akson demet dokusunun axo-aksonal etkileşimini ve kendiliğinden oluşumunu kolaylaştırır, bu protokolle benzersiz bir şekilde elde edilirken, spontan demet oluşumu veya kılavuzlu aksonal yönelim tek başına diğer protokoller12 , 13,14ile elde edilebilir. Tipik bir deneyde, çok az hücre küresellerden mikro kanallara göç eder ve çoğu hücre sferoidlerin yakınında kalır. Bu yöntem, aksonları hücre gövdelerinden ayırmak için boyuta bağımlı fiziksel bariyerler (örneğin, mikrogroovlar veya mikropore filtreleri) kullanmadan aksonların sferoidlerden kendiliğinden ayrılmasını sağlar.
Ortaya çıkan MNO morfolojik, biyokimyasal ve fiziksel analizler de dahil olmak üzere çeşitli incelemelere tabi tutulabilir. Hücre gövdesi ve genişletilmiş akson demeti kesilerek fiziksel olarak izole edilebilir ve biyokimyasal tahliller gibi aşağı akış deneyleri için ayrı ayrı analiz edilebilir. RNA ve protein gibi biyolojik malzemeler, RT-PCR ve batı şişkinliği de dahil olmak üzere düzenli biyokimyasal tahliller için sadece birkaç akson demetinden izole edilebilir. Burada, akson fasiküllerinin gelişiminin ve hastalığının altında kalan mekanizmayı incelemek için çekici bir fizyolojik ve patolojik model sunan iPS hücrelerinden motor sinir organoidi üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Akson fasikülleri sinir sisteminde gözlenen başlıca yapısal motiflerden biridir. Akson fasiküllerinin bozulması gelişimsel ve nörodejeneratif hastalıklara neden olabilir. Her ne kadar çok sayıda akson çalışması yapılmış olsa da, sağlam üç boyutlu in vitro modellerin eksikliği nedeniyle akson fasiküllerinin oluşumu ve işlev bozukluğu anlayışımız hala sınırlıdır. Burada, mikroakışkan tabanlı bir doku kültürü çipinde insan kaynaklı pluripotent sap (iPS) hücrelerinden bir motor sinir organoidinin (MNO) hızlı üretimi için adım adım bir protokol açıklıyoruz. İlk olarak, yöntem için kullanılan çiplerin imalatı açıklanmaktadır. İnsan iPS hücrelerinden motor nöron sferoid (MNS) oluşur. Daha sonra, farklılaştırılmış MNS çipe aktarılır. Bundan sonra, aksonlar kendiliğinden küreselden büyür ve çipte bulunan bir mikrokanal içinde bir fasikül haline gelir ve bu da küreselden uzatılmış bir akson demeti taşıyan bir MNO dokusu oluşturur. Aşağı akış analizi için, MNO'lar morfolojik analizler için sabitlenecek çipten çıkarılabilir veya biyokimyasal analizlerin yanı sıra kalsiyum görüntüleme ve çoklu elektrot dizi kayıtları için incelenebilir. Bu protokol ile oluşturulan MNO'lar ilaç testini ve taramasını kolaylaştırabilir ve aksion fasiküllerinin gelişiminin ve hastalıklarının altında kalan mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Motor nöronlar 3D farklılaşma işlemlerinde 12-14 gün içinde farklılaştırılmıştır (Şekil 4 ve Şekil 5). Daha da önemlisi, hücrelerin% 60'ından fazlası farklılaşma sırasında motor nöron belirteci HB9'ı ifade etti. İmmünohistokimya, MNS'deki hücrelerin yaklaşık% 80'inin SMI32 pozitif motor nöronlar olduğunu ortaya koydu. HB9 ve SMI32, kurulan erken aşama motor nöron belirteçleridir15,16. HB9 ve SMI32 ifadesi, motor nöronların hücresel kimliğini sağlamak için onaylanması gereken temel parametrelerdir. Kültür yongasına bir MNS girdikten sonra, aksonlar kanala uzanır ve bir akson demeti oluşur. Fiziksel kılavuz olarak hizmet veren mikrokanaller nedeniyle, aksonlar MNS'den uzaktır ve axo-axonal etkileşim ile bir demet oluşturur (Şekil 6A). Bir MNO'nun oluşumunu doğrulamak için mikroskobik gözlemle akson demetinin oluşumunu onaylamak önemlidir. Başarılı bir MNO, kanaldaki demetin dışında 50 μm'den daha geniş bir akson demeti ve birkaç izole akson taşır. Aksonların ilk uzaması, sferoidin girişinden 24 saat sonra gözlemlenebilir. Sonraki 3-4 gün içinde, aksonlar mikrokananın merkezine ulaştı ve daha sonra ek 10 gün içinde diğer uca ulaşır (Şekil 6A). Sonuç olarak, aksonlar bir çipte 2-3 hafta içinde düz ve tek yönlü bir demet oluşturdular ve bundan sonra nöronal aktiviteler gözlendi.
Motor sinir organoidleri biyolojik analiz için PDMS'yi mikroskop camından ayırarak çipten toplanabilir (Şekil 6B). Akson demetleri ve hücre gövdeleri mikroskop altında cerrahi bıçak veya cımbız kullanılarak kesilerek izole edilebilir (Şekil 6B). RNA ve protein de dahil olmak üzere bu biyolojik malzemeler RT-PCR ve batı şişkinliği gibi düzenli biyokimyasal tahliller için kullanılabilir. MNO'ların akson demetlerinde, batı şişkinliğinde nükleer veya dendritik yapıcı proteinler tespit edilmemiştir (Şekil 6C).
Bir kalsiyum göstergesi (Fluo-4 AM) ile birlikte, doku kültürü çipinde nöronal aktivite yakalanabilir. MNO içinde sferoid ve akson demetinde motor nöronların spontan aktivitesi gözlendi. Ayrıca, sinirsel aktiviteler çok elektrotlu bir dizi sistemi kullanılarak gözlendi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Şekil 1: PDMS doku kültürü çipinin boyutu. (A) Doku kültürü çipinin fotomask. (B) Doku kültürü çipinde mikrokanel boyutları. Motor nöron sferoidini tutmak için taban odasının çapı 2 mm ve odanın üzerindeki PDMS deliği 1,5 mm'dir. İki odacık arasında köprü kuran bir mikrokananın genişliği ve yüksekliği 150 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Şekil 2: Motor nöron farklılaşması şematik illüstrasyonu. (A) Farklılaşma adımları nöral indüksiyon, motor nöron soyuna desenleme ve motor nöronların olgunlaşmasını içeriyordu. (B) iPS hücrelerinden motor nöron küresel (MNS) oluşturmak için iki seçenek: 3D protokol ve motor nöronların ayrışma adımına sahip bir 2D protokol. Motor sinir organoidi (MNO) her iki protokolle de elde edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Şekil 3: Bodrum membran matrisi kaplaması ve motor nöron küresel tanıtımı için adım adım protokol. (A) Doku kültürü çipinin kanalında bodrum membran matrisi kaplaması. (B) Çipin deliğine MNS girişi. (C) Tükenmiş ortamın aspirasyonu ile kültür orta değişimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Şekil 4: 2D ve 3D motor nöron farklılaşması. (A) Temsili 3D MNS farklılaşma süresi (3D protokolü). MNS'nin boyutu zamanla kademeli olarak arttı. Ölçek çubuğu: 500 μm. (B) -D2, D0, D1, D6, D12 (2D protokolü) üzerinde 2D farklılaşma süresi. Ölçek çubuğu: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Şekil 5: Motor nöronların karakterizasyonu. (A) (Sol) SMI-32 antikor ve DAPI ile boyanmış bir MNS kriyoseksiyon. (Orta) Bodrum membran matrisi kaplı bir yüzeyde replated MNS faz kontrast görüntüsü. Aksonal uzama gözlendi. (Sağ) Sinapsin I ve Tuj1 antikorları ile boyanmış replated MNS aksonları. Ölçek çubuğu: 500 μm (Sol ve Orta) ve 50μm (Sağ). (B) Tuj ve HB9 antikorları ile bağışıklık sistemi baskılanmış 2D motor nöronların temsili bir görüntüsü. Ölçek çubuğu: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Şekil 6: Bir kültür çipinde üretilen bir motor sinir organoidinin (MNO) karakterizasyonu. (A) D32'de akson uzama ve kalın akson demeti oluşumunun temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu: 500 μm. (B) Motor sinir organoidinin (MNO) SMI-32 ve DAPI tarafından immünostainingi. Aksonlar ve hücre gövdeleri fiziksel olarak kesilerek izole edilebilir. Ölçek çubuğu: 1 mm. (C) Batı şişkinliği ile ölçülen aksonlardan ve hücre gövdelerinden proteinin saflığı. Bir dendritik belirteç olan MAP2, aksonal proteinde tespit edilmedi, aksional işaretleyici Tau1 ise aksonal proteinde zenginleştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Bu protokol, bir doku kültürü çipinde bir sferoidden uzatılan sağlam bir akson demetinin kendiliğinden montajı yoluyla insan iPS hücre türevi motor sinir organoidini imal etmek için kapsamlı bir prosedür sağlar.

Üç Boyutlu Motor Sinir Organoid Üretimi

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Görüntüleme.  The University of Tokyo. Bu protokol, bir doku kültürü çipinde bir sferoidden uzatılan sağlam bir akson demetinin kendiliğinden montajı yoluyla insan iPS hücre türevi motor sinir organoidini imal etmek için kapsamlı bir prosedür sağlar.

Video: Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Nörobilim

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

Ek Motor Alanında Fiber Bağlantıları Gözden Geçirildi: Fiber Disseksiyonu Metodolojisi, DTI ve Üç Boyutlu Dokümantasyon

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Sinirsiz Kuşak ve Uzun Süreli Bakım<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Beyin Yapılarının Üç Boyutlu Şekil Modellemesi ve Analizi

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Fibroblastların ve Schwann Hücrelerinin İn vitro duyusal ve motor sinirlerden arındırması

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...