Este estudo foi apoiado pela Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 e 18K19903, Core-2-core e Beyond AI institute.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

Em parte deste protocolo, uma patente foi licenciada para jiksak bioengenharia, Inc. que foi fundada por Jiro Kawada.

Este protocolo descreve a formação de um organoide nervoso motor (MNO) que tem um feixe de axônio estendido a partir de um esferoide de neurônio motor gerado a partir de células iPS humanas. O pacote de axônio formado é espesso, flexível e bem organizado em estruturas unidirecionais. Ao dissecar o feixe de axônio, a proteína axonal de alta pureza e o RNA podem ser obtidos suficientemente para análises bioquímicas. A atividade neuronal pode ser medida em feixes de axônio e esferoides com imagem de cálcio. A contaminação de proteínas nucleares e dendríticas no liseto axonal não foi detectada pela mancha ocidental, demonstrando que nosso método separou eficientemente os axônios dos corpos celulares e dendritos.
Uma das vantagens deste protocolo é a rápida diferenciação e geração de MNO equipado com um pacote de axônio, no qual todos os processos podem ser feitos em 4 semanas com o protocolo 3D e 5-6 semanas usando o protocolo 2D. Isso é curto em comparação com outros protocolos que normalmente levam de 3 a 4 semanas para simplesmente se diferenciar em MN de células-tronco embrionárias e células iPS17 e leva mais 2-4 semanas para obter alongamento axonal. O protocolo 3D é geralmente preferido em relação ao protocolo 2D devido ao menor tempo de diferenciação, menos etapas e riscos técnicos reduzidos sem a etapa de dissociação em comparação com o protocolo 2D. O chip de cultura tecidual baseado em microfluidic foi projetado de forma que os axônios de MNS possam alongar em direção ao outro compartimento através do microcanal, o que facilita a formação de um feixe de axônios induzindo interações axo-axonanas e afinidade entre axônios. Por causa da simples configuração experimental, todos os protocolos descritos aqui podem não apenas ser realizados por bioengenheiros, que estão familiarizados com a manipulação de um chip de cultura tecidual, mas também biólogos e neurocientistas que não estão familiarizados com microfluidos e técnicas de microfabúcia. Deve-se notar que as etapas 1 e 2 também podem ser realizadas utilizando um serviço de fabricação externa.
Um dos passos críticos para a realização do protocolo é uma mudança sequencial do meio cultural. Aconselhável mudar completamente o meio de cultura a cada etapa durante a diferenciação para que fatores no meio gasto não perturbem a diferenciação de MN. Outro ponto crítico deste protocolo é manter células iPS indiferenciadas em boa qualidade. A qualidade da cultura celular iPS inicial afeta significativamente a eficiência para a obtenção de neurônios motores e MNO. Outro ponto é que o diâmetro do MNS deve ser menor do que o tamanho do orifício do chip (1,5 mm). Esferoides maiores não podem entrar na câmara, e potencialmente experimentam necrose hipóxica grave na parte central. O tamanho dos MNSs pode ser controlado alterando um número inicial de semeadura de células iPS (em protocolo 3D) ou neurônios motores (em protocolo 2D). A densidade de semeadura das células deve ser otimizada para cada linha celular iPS.
Dispositivos microfluidos compartimentados com microgrooves e pequenos filtros de poros têm sido amplamente utilizados para separar axônios de corpos celulares e dendritos. Esta técnica também pode separar axônios de corpos celulares e dendrite, com abundância superior de axônios em tecidos empacotados. Em comparação com os outros métodos, uma das principais limitações deste método é que ele não pode separar duas mídias culturais diferentes no desenho atual do chip de cultura tecidual, o que dificulta a capacidade de co-cultura de duas células diferentes que requerem duas mídias distintas. Outra limitação é que o chip PDMS colocou restrição predeterminada no tamanho do tecido. Um esferoide maior que o orifício não pode entrar na câmara, e o feixe de axônio não pode crescer mais grosso do que a largura do canal microfluido.
Este método pode ser aplicado a outros tipos de neurônios. Nosso grupo mostrou capacidade para modelar um trato cerebral usando um método modificado combinado com técnicas organoides cerebrais18. Esferoides corticais foram introduzidos em ambos os compartimentos e os axônios espontaneamente alongados reciprocamente em direção a cada esferoide, e posteriormente um feixe de axônio formado espontaneamente. Como resultado, dois esferoides cortical podem ser conectados através de um feixe de axônio, e o tecido poderia ser obtido como uma peça. Isso demonstra que a abordagem é altamente versátil para formar tecidos de feixe de axônio, independentemente dos tipos de células neuronais. Neste protocolo, foram utilizadas células iPS humanas, no entanto, outras células-tronco, incluindo células-tronco humanas e células-tronco neurais humanas, podem ser usadas com modificações no protocolo apresentado. Esferoides 3D de neurônios podem ser gerados por diversos protocolos19,20. Este método de fabricação de tecidos com um feixe de axônio pode potencialmente ser combinado no futuro com os outros protocolos de diferenciação para fazer esferoide 3D MN. Além disso, a espessura e o comprimento do feixe de axônio podem ser controlados simplesmente alterando a largura e a altura dos microcanais do chip de cultura tecidual para desenvolvimentos futuros.
Acreditamos que este protocolo pode ser usado para testes e rastreamento de drogas e pode contribuir para a compreensão dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e doenças dos fascicles de axônio.

Os neurônios motores espinhais (MN) estendem os axônios aos músculos esqueléticos para controlar o movimento corporal. Suas trajetórias axonal são altamente organizadas e reguladas no processo de desenvolvimento. Apesar de muitos estudos sobre extensão de axônio e orientação1,os mecanismos de formação organizada de axônio ainda estão sendo investigados. Axônios de neurônios motores são frequentemente danificados por doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA)2, mas mecanismos fisiopatológicos dos danos nos fascicles de axônio são mal compreendidos. Assim, é necessário um modelo fisiológico e patológico para recapitular a formação e regressão do feixe de axônio no campo.
Um neurônio motor derivado de células-tronco humanas é uma plataforma promissora para entender o desenvolvimento e doenças como a ALS3. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (células iPS) podem ser usadas para modelar doenças usando células derivadas do paciente. Até o momento, vários métodos de diferenciação de células-tronco pluripotentes em MN foram relatados4,5,6. No entanto, os axônios dos neurônios na cultura bidimensional são orientados aleatoriamente e não recapitulam o microambiente in vivo dentro dos nervos em desenvolvimento nos quais os axônios são montados unidiretamente através de densas interações axo-axonanas7. Para superar essa questão, desenvolvemos uma técnica para gerar um tecido tridimensional semelhante ao nervo motor a partir das células iPS humanas8, e nomeamos o tecido como organoide do nervo motor (MNO). O MNO consiste em corpos celulares localizados em um esferoide de neurônio motor (MNS) e um fascicle axonal estendido do esferoide. Os axônios no fascicle são unidiretamente orientados, que se assemelha a axônios no desenvolvimento de nervos motores. Assim, os MNOs fornecem exclusivamente um microambiente axonal fisiológico, o que não foi feito por nenhum outro método de cultura neuronal previamente desenvolvido.
Neste protocolo, descrevemos métodos para fabricação de chips de cultura tecidual, rápida diferenciação de neurônios motores e formação organoide do nervo motor em chips desenvolvidos. Nosso chip de cultura tecidual é muito simples, e contém apenas um compartimento para aceitar um esferoide, um microcanal para formar um feixe de axônio, e um compartimento para abrigar terminais de axônio. O dispositivo não contém estruturas complexas, incluindo microvalhões ou filtros de microporos que muitas vezes são usados para separar axônios e corpos celulares pelo tamanho9,10. Assim, nossos dispositivos podem ser facilmente fabricados seguindo as etapas descritas neste protocolo se uma configuração de fotolitografia estiver disponível.
A rápida diferenciação das células iPS humanas é alcançada com uma combinação otimizada de fatores de indução e padronização (SB431542, LDN-193189, ácido retinóico (RA) e agonista suavizada (SAG)) e fatores de aceleração (SU5402 e DAPT). Foi relatado que a combinação de SU5402 e DAPT acelera a diferenciação de neurônios periféricos e células de crista neural11. Neste protocolo, oferecemos três métodos diferentes para gerar MNOs, para que os leitores possam decidir sobre um método mais adequado às suas necessidades. Recomendamos a realização da diferenciação das células iPS humanas após a formação de um esferoide (o método 3D), uma vez que o MNS diferenciado pode ser transferido diretamente para um chip de cultura tecidual. Alternativamente, as células iPS humanas podem ser diferenciadas em neurônios motores na cultura monocamada (2D) e, em seguida, criadas em esferoides de neurônio motor tridimensional, como relatamos anteriormente8. Atualizamos o protocolo, e com o método de diferenciação tridimensional descrito neste protocolo, a transição do 2D para o 3D pode ser evitada e os MNOs podem ser obtidos com menor tempo de diferenciação, menos etapas e riscos técnicos reduzidos sem a etapa de dissociação. Neurônios disponíveis comercialmente também podem ser usados para gerar MNS para reduzir o tempo de diferenciação.
Para gerar um MNO, nós cultuamos um MNS no chip de cultura de tecidos. Os axônios alongam-se do esferoide e estendem-se para o microcanal no qual os axônios se reúnem e se alinham unidiretamente. Isso facilita a interação axonal e a formação espontânea de um tecido de axônio unidirecional bem montado no microcanal, que é alcançado exclusivamente por este protocolo, enquanto a formação espontânea do feixe ou a orientação axonal guiada por si só pode ser alcançada por outros protocolos12,13,14. Em um experimento típico, poucas células migram de esferoides para o microcanal e a maioria das células permanece nas proximidades. Este método permite que os axônios sejam espontaneamente separados dos esferoides sem o uso de barreiras físicas dependentes de tamanho (por exemplo, microgrooves ou filtros de microporos) para separar axônios dos corpos celulares.
O MNO resultante pode ser submetido a diversos exames, incluindo análises morfológicas, bioquímicas e físicas. O corpo celular e o feixe de axônio estendido podem ser fisicamente isolados pelo corte e podem ser analisados separadamente para experimentos a jusante, por exemplo, ensaios bioquímicos. Materiais biológicos, incluindo RNA e proteína, podem ser isolados de apenas alguns feixes de axônio para ensaios bioquímicos regulares, incluindo RT-PCR e manchas ocidentais. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração de organoide nervoso motor a partir de células iPS, que oferece um modelo fisiológico e patológico atraente para estudar o mecanismo de desenvolvimento subjacente e doença dos fascicles de axônio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Um fascicle de axônios é um dos principais motivos estruturais observados no sistema nervoso. A interrupção dos fascicles de axônio pode causar doenças desenvolvitórias e neurodegenerativas. Embora inúmeros estudos de axônios tenham sido conduzidos, nosso entendimento da formação e disfunção de fascicles de axônio ainda é limitado devido à falta de modelos in vitro tridimensionais robustos. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para a rápida geração de um organoide nervoso motor (MNO) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPS) em um chip de cultura de tecido baseado em microfluidic. Em primeiro lugar, descreve-se a fabricação de chips usados para o método. A partir de células iPS humanas, forma-se um esferoide de neurônio motor (MNS). Em seguida, o MNS diferenciado é transferido para o chip. A partir daí, os axônios crescem espontaneamente do esferoide e se reúnem em um fascículo dentro de um microcanal equipado no chip, o que gera um tecido MNO carregando um feixe de axônios estendidos do esferoide. Para a análise a jusante, os MNOs podem ser retirados do chip para serem fixados para análises morfológicas ou dissecados para análises bioquímicas, bem como imagens de cálcio e gravações de matriz de vários eletrodos. Os MNOs gerados com este protocolo podem facilitar o teste e rastreamento de medicamentos e podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento subjacente e doenças dos fascicles de axônio.

Os neurônios motores foram diferenciados dentro de 12-14 dias em procedimentos de diferenciação 3D(Figura 4 e Figura 5). É importante ressaltar que mais de 60% das células expressaram o marcador de neurônio motor HB9 durante a diferenciação. A imunohistoquímica revelou que aproximadamente 80% das células no MNS eram neurônios motores SMI32 positivos. HB9 e SMI32 são os marcadores de neurônio motor em estágio inicial estabelecidos15,16. A expressão de HB9 e SMI32 são os parâmetros-chave que precisam ser confirmados para garantir a identidade celular dos neurônios motores. Após a introdução de um MNS no chip de cultura, os axônios se estendem para o canal e um pacote de axônio se forma. Devido aos microcanais que servem como guias físicos, os axônios alongam-se do MNS e formam um pacote por interação axo-axonal(Figura 6A). É essencial confirmar a formação do feixe de axônio por observação microscópica para confirmar a geração de um MNO. Um MNO bem sucedido carrega um pacote de axônio maior que 50 μm e poucos axônios isolados fora do feixe no canal. O alongamento inicial dos axônios pode ser observado 24 horas após a introdução do esferoide. Nos próximos 3-4 dias, os axônios chegaram ao centro do microcanal e, em seguida, chegam à outra extremidade dentro de mais 10 dias(Figura 6A). Consequentemente, os axônios montaram e formaram um feixe reto e unidirecional em 2-3 semanas em um chip, e atividades neuronais foram observadas posteriormente.
Organoides do nervo motor podem ser coletados do chip desvinculando o PDMS do vidro do microscópio para análise biológica(Figura 6B). Pacotes de axônio e corpos celulares podem ser dissecados e isolados cortando usando uma faca cirúrgica ou pinça sob um microscópio(Figura 6B). Esses materiais biológicos, incluindo RNA e proteína, podem ser usados para ensaios bioquímicos regulares, como RT-PCR e mancha ocidental. Em feixes de Axônio de MNOs, proteínas fabricantes nucleares ou dendríticas não são detectadas em manchas ocidentais(Figura 6C).
Em combinação com um indicador de cálcio (Fluo-4 AM), a atividade neuronal pode ser capturada no chip de cultura tecidual. A atividade espontânea dos neurônios motores no esferoide e no feixe de axônio foram observadas dentro do MNO. Além disso, as atividades neurais foram observadas utilizando-se um sistema de matriz multi-eletrodo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figura 1: A dimensão do chip de cultura tecidual PDMS. (A) Fotomask do chip de cultura tecidual. (B) Dimensões do microcanal no chip de cultura tecidual. O diâmetro da câmara base para segurar o esferoide do neurônio motor é de 2 mm e o orifício de PDMS acima da câmara é de 1,5 mm. A largura e a altura de um microcanal de duas câmaras são de 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figura 2: Ilustração esquemática da diferenciação do neurônio motor. (A) As etapas de diferenciação envolveram indução neural, padronização na linhagem de neurônios motores e maturação de neurônios motores. (B) Duas opções para criar esferoide de neurônio motor (MNS) a partir de células iPS: protocolo 3D, e um protocolo 2D com etapa de dissociação de neurônios motores. Organoide do nervo motor (MNO) pode ser obtido por ambos os protocolos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figura 3: Protocolo passo a passo para revestimento da matriz da membrana do porão e introdução de esferoides de neurônios motores. (A) Revestimento da matriz de membrana do porão no canal do chip de cultura tecidual. (B) Introdução MNS no orifício do chip. (C) Cultura média de mudança por aspiração de meio exausto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figura 4: Diferenciação de neurônio motor 2D e 3D. (A) Curso de tempo de diferenciação 3D MNS representativa (protocolo 3D). O tamanho do MNS aumentou gradualmente ao longo do tempo. Barra de escala: 500 μm. (B) Curso de tempo de diferenciação 2D em -D2, D0, D1, D6, D12 (protocolo 2D). Barra de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figura 5: Caracterização dos neurônios motores. (A) (Esquerda) Uma crioseção de um MNS manchado com anticorpo SMI-32 e DAPI. (Meio) Uma imagem de contraste de fase de MNS replalado em uma superfície revestida de matriz de membrana do porão. Observou-se alongamento axonal. (À direita) Axons de MNS repladados manchados com anticorpos Synapsin I e Tuj1. Barra de escala: 500 μm (Esquerda e Médio) e 50μm (Direita). (B) Uma imagem representativa de neurônios motores 2D imunossuou com anticorpos Tuj e HB9. Barra de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figura 6: Caracterização de um organoide nervoso motor (MNO) gerado em um chip de cultura. (A) Imagens representativas do alongamento do axônio e da formação de feixe de axônio espesso na D32. Barra de escala: 500 μm. (B) Imunostaining de organoide nervoso motor (MNO) por SMI-32 e DAPI. Axônios e corpos celulares podem ser isolados cortando fisicamente. Barra de escala: 1 mm. (C) Pureza da proteína de axônios e corpos celulares quantificado por mancha ocidental. MAP2, um marcador dendrático, não foi detectado em proteína axonal, enquanto o marcador axonal Tau1 é enriquecido na proteína axonal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Este protocolo fornece um procedimento abrangente para fabricar organoide nervoso motor derivado de células iPS humanas através da montagem espontânea de um robusto feixe de axônios estendidos de um esferoide em um chip de cultura tecidual.

Geração organoide do nervo motor tridimensional

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K visualizações.  The University of Tokyo. Este protocolo fornece um procedimento abrangente para fabricar organoide nervoso motor derivado de células iPS humanas através da montagem espontânea de um robusto feixe de axônios estendidos de um esferoide em um chip de cultura tecidual.

Vídeo: Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nerve transecção e Time-lapso de Comportamentos de células gliais em Zebrafish ao vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Neurociência

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

Imagem tridimensional e análise de mitocôndrias dentro as fibras nervosas intraepidérmicas humana

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

Conexões de Fibra da Área Suplementar de Motor Revisitada: Metodologia de Dissecção de Fibras, DTI e Documentação Tridimensional

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Geração e Manutenção a Longo Prazo de Nerve-free<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

Modelagem e análise tridimensional da forma de estruturas do cérebro

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...