Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio R01MH113858 (para R.K.), do National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS), r01MH113858 (para R.K.), prêmio kl2 TR002542 (PL). um National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (para R.K.), um Sydney R Baer Jr Foundation Grant (para P.L.) o Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (para R.K.), a Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (para R.K.), o Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (para R.K.), o Harvard Stem Cell Institute (para R.K.) e por Steve Willis e Elissa Freud (para R.K.). Agradecemos à Dra.

Os iPSCs humanos foram reprogramados dos fibroblastos de doadores saudáveis por meio de protocolo aprovado pelos Conselhos de Revisão Institucional do Hospital Geral de Massachusetts e do Hospital McLean, e caracterizados como descritos em estudos anteriores44,45,46.
NOTA: Brevemente, os fibroblastos foram reprogramados para o iPSC através da reprogramação genética baseada em mRNA47. Os iPSCs foram mantidos em células-tronco média (SCM) (ver lista de material) e armazenados a uma densidade de ~1,2 x 102 células/mL com 1 mL de SCM, 10 μM com inibidor de proteína quinase associada a rho (ROCKi) Y-27632, e 10% (v/v) sulfeto de dimetil (DMSO), em frascos criopreservados em nitrogênio líquido a -160 °C. Todos os procedimentos a seguir são realizados em um gabinete de biossegurança, a menos que seja declarado o contrário.
1. Diluição da matriz da membrana do porão e revestimento da placa
<ol><li>Fator de crescimento diluído (1:50) reduziu a matriz de membrana do porão purificada do tumor Engelbreth-Holm-Swarm no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco sem vermelho fenol.</li>
	<li>Placas de cultura de células de revestimento com a quantidade apropriada de matriz de membrana de porão diluída (ou seja, placa de 6 poços = 1mL, placa de 12 poços = 0,5 mL) e incubar essas placas a 37 °C por pelo menos 1 hora.</li>
</ol>2. manutenção iPSC
NOTA: A confluência máxima por poço em uma placa de fundo plano de 6 poços é ~1,2 x 106 células.
<ol><li>Descongelar iPSCs criopreservados em SCM com 10 μM Y-27632 e placa em uma placa de 6 poços revestida com fator de crescimento diluído reduziu a matriz de membrana do porão.</li>
	<li>Mantenha iPSCs em SCM com 10 μM Y-27632 nas primeiras 24 horas após o descongelamento. Mude para meio fresco após 24 horas.</li>
	<li>Mantenha iPSCs em SCM até que as células atinjam 80-90% de confluência antes da passagem.<ol>
<li>Calcule quantas iPSCs serão necessárias para diferenciação multiplicando a densidade desejada para diferenciação (15.600 células/cm2) pela área superficial do poço. Para uma placa de fundo plano de 6 poços, multiplique 15.600 células/cm2 por 9,6 cm2 para um total de 149.760 células/poço.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para passar, lave as células com a Solução de Sal Balanceado (HBBS) da Hanks. Em seguida, incubar as células com ácido etilenodiaminatotraacético não enzimático (EDTA) (ver lista de materiais) por 5 minutos a 37 °C.<ol>
<li>Use um raspador de células para retirar suavemente as células. Coletar células em SCM fresco.</li>
		<li>Células de placas em placas de cultura celular revestidas com SCM diluído e manter células conforme descrito na etapa 2.3 ou armazená-las em ~1,2 x 106 células/mL em 1 mL de SCM, 10 μM Y-27632, e 10% DMSO (v/v) em frascos criopreservados em nitrogênio líquido a temperatura de -160 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Diferenciação de iPSCs para BMECs
NOTA: EDTA não enzimática separa as células em aglomerados. EDTA enzimática (ver Tabela de Materiais) separa as células em suspensão de célula única. O ácido retinóico (RA) deve ser protegido contra a luz.
<ol><li>Lave iPSCs uma vez com o Phosphate Buffer Saline (DPBS) de Dulbecco. Incubar com EDTA enzimática (1 mL para placa de 6 poços, 0,5 mL para placa de 12 poços e 0,25 mL para placa de 24-bem) por aproximadamente 5 minutos a 37 °C para produzir uma única suspensão celular.</li>
	<li>Coletar células e centrífugas a 300 x g (força centrífuga relativa) por 5 minutos à temperatura ambiente. Pelotas de células resuspendas em SCM contendo 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Determine a densidade celular usando o Trypan Blue e o contador de células automatizado ou um dispositivo hemótmetro. Células de placa a uma densidade de 15.600 células/cm2 ou 149.760 células/poço de uma placa de fundo plano de 6 poços (com uma área superficial de 9,6 cm2/bem) em SCM contendo 10 μM Y-27632 por 24 horas.</li>
	<li>Inicie a diferenciação após 24 horas mudando SCM para E6 médio. Mude o E6 diariamente para os próximos 4 dias.</li>
	<li>No dia 4 de diferenciação, substitua o E6 médio por hESFM suplementado com suplemento B27 diluído (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA. Não troque este meio pelas próximas 48 horas.</li>
	<li>Prepare 200 mL de hESFM com diluído (1:200) B27, misture 1 mL de suplemento B27 concentrado de 50x a 199 mL de hESFM.</li>
	<li>Prepare 20 ng/mL de bFGF reconstituindo 50 μg de bFGF em 250 μL de buffer Tris (5 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl) para fazer 200 μg/mL solução de estoque. Prepare 200 mL de hESFM contendo 20 ng/mL bFGF misturando 20 μL de 200 μg/mL bFGF com 200 mL de hESFM.</li>
	<li>Prepare 10 μM RA fazendo primeiro uma solução de estoque de 40 mg/mL de RA adicionando 2,5 mL de DMSO a 100 mg de pó de RA. Diluir esta concentração para 3 mg/mL para fazer uma solução de estoque de 10 mM. Prepare 200 mL de hESFM contendo RA de 10 μM misturando 200 μL de RA de 10μM em 200 mL hESFM.</li>
</ol>4. Revestimento de colágeno IV (COL4) e fibronectina (FN) Matriz para Purificação de BMEC derivado do iPSC
<ol><li>Adicione 2 mL de água estéril a 2 mg de FN para fazer uma solução de estoque de 1 mg/mL FN. Adicione 5 mL de água estéril a 5 mg de COL4 para fazer uma solução de estoque COL4 de 1 mg/mL.<ol>
<li>Deixe a FN dissolver por pelo menos 30 minutos a 37 °C e o COL4 se dissolver à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de estoque FN diluída em água estéril para uma concentração final de 100 μg/mL e solução de estoque COL4 para uma concentração final de 400 μg/mL.</li>
	<li>Cubra as placas desejadas (placa de 6-bem = 1 mL de solução COL4/FN, placa de 12 poços = 0,5 mL, placa de 24-bem= 0,25 mL e placa filtrada de 12 transwell = 0,25 mL) com a mistura de 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN.</li>
	<li>Incubar placas por uma mínima de 2 horas ou durante a noite a 37 °C; para placas filtradas Transwell, recomenda-se um mínimo de 4 horas.</li>
</ol>5. Subcultura e purificação de BMECs derivados do iPSC
NOTA: A incubação com EDTA enzimática pode levar mais de 15 minutos, dependendo da confluência das células no dia 6 de diferenciação.
<ol><li>No dia 6 de diferenciação, lave as células duas vezes com DPBS. Incubar com 1 mL de EDTA enzimática por pelo menos 15 minutos a 37 °C até obter uma única suspensão celular.</li>
	<li>Coletar células através de centrifugação a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Pelotas de célula resuspend com hESFM fresco com suplemento B27 diluído (1:200), 20 ng/mL bFGF e 10 μM RA.</li>
	<li>Células de sementes em placas revestidas com uma mistura de 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN. Células de sementes usando uma razão de 1 poço de uma placa de 6 poços para 3 poços de uma placa de 12 poços, 3 poços de uma placa filtrada de 12 transwell, ou 6 poços de uma placa de 24 poços.</li>
	<li>IPSCs indiferenciados da mesma linha celular em placa filtrada de 12 transwell revestidas de COL4/FN como controle negativo para análise de TEER.</li>
	<li>Após 24 horas de subcultura, troque de médio para hESFM apenas com suplemento B27. Não são necessárias alterações médias após esta etapa.</li>
</ol>6. Ensaio de broto
<ol><li>Colete os BMECs derivados do iPSC do dia 8 e semeeá-los a 100.000 células/poço em uma placa de fundo plano de 24 poços recém-revestida com 200 μL/cm2 de matriz de membrana de porão.</li>
	<li>Trate essas células com hESFM com diluído (1:200) B27 e 40 ng/mL do fator de crescimento endotelial vascular A (VEGFA165).</li>
	<li>Observe as células a cada 24 horas e troque o meio a cada dois dias.</li>
</ol>7. Imunocytoquímica (ICC)
NOTA: O ICC é realizado em placas de fundo plano de 24 poços.
<ol><li>Após 48 horas de subcultura (dia 8), lave as células duas vezes com DPBS. Fixar células com 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 minutos.</li>
	<li>Lave as células três vezes com DPBS, 5 minutos por lavagem. Células pré-bloco por 1 hora à temperatura ambiente em DPBS com 5% de soro de burro e 0,3% Triton X-100 (v/v).</li>
	<li>Incubar com anticorpos primários: camundongo anti-humano-PECAM1 (1:100, estoque 0,5 mg/mL), coelho anti-humano-TJP1 (1:200, estoque 0,53 mg/mL), rato anti-humano-CLDN5 (1:200, estoque 0,5 mg/mL), camundongo anti-humano-OCLN (1:200, estoque 0,5 mg/mL), e coelho anti-humano-SLC2A1 (1:100, estoque 0,2 mg/mL) em DPBS contendo 5% de soro de burro durante a noite a 4°C.<ol>
<li>Enxágüe células uma vez com DPBS e depois lave cinco vezes por 5 minutos por lavagem com DPBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar células com anticorpos secundários: burro-anti-coelho Alexa Fluor 555 (1:200) e burro-anti-mouse 488 (1:200) em DPBS contendo 5% de soro de burro por 1 hora.</li>
	<li>Após esta incubação, adicione Hoechst 33342 trihidrocloide trihidrocloride diluído (1:1000) em DPBS por 10 minutos.<ol>
<li>Remova a solução Hoechst 33342 e enxágue uma vez com DPBS e lave quatro vezes com DPBS por 5 minutos por lavagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualize células em microscópios de fluorescência para procurar expressão e localização de fabricantes de células.</li>
</ol>8. Medição e Análise do TEER
NOTA: As placas filtradas de Corning 12-Transwell são equipadas com filtros compostos por 1,12 cm2 membranas tereftalatos de polietileno e poros de 0,4 micrômetros. As medições teer são obtidas em réplicas técnicas (3 por poço) e biológicas (3 poços por linha celular e/ou condição).
<ol><li>24 horas após a subcultura (dia 7), meça o TEER usando eletrodos de pauzinho e um voltohmômetro a cada 24 horas. Consulte o manual do usuário voltohmômetro para obter instruções específicas sobre a obtenção de medições.<ol>
<li>Para medir o TEER, carregue o instrumento voltohmômetro na noite anterior. Limpe levemente o instrumento e os eletrodos de pauzinho com 70% de etanol antes de colocá-los no capô de segurança.</li>
		<li>Ligue a potência e calibra o medidor ohm conforme recomendado pelo fabricante.</li>
		<li>Conecte os eletrodos de pauzinho e enxágue os eletrodos com 70% de etanol seguidos pelo DPBS.</li>
		<li>Coloque o eletrodo final mais curto na pastilha trans-bem (a câmara apical) e a extremidade mais longa na câmara basolateral.</li>
		<li>Primeiro meça um poço em branco que é revestido apenas com COL4/FN. Então meça os outros poços.</li>
		<li>Enxágüe rapidamente eletrodos de pauzinho com 70% de etanol seguidos por DPBS ao medir diferentes condições (ou seja, medir diferentes linhas celulares).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depois de todas as medidas (em Ω) terem sido registradas, enxágue eletrodos de pauzinho com 70% de etanol e, em seguida, água estéril. Limpe suavemente o eletrodo e deixe-o secar no capô de segurança.</li>
	<li>Em média, os valores de TEER triplicado (em Ω) do poço em branco e subtraia esse valor médio de cada valor TEER bruto por condição.<ol>
<li>Média dos valores subtraídos e multiplicá-los por 1,12 cm2 (a área superficial da inserção de 12 transwell).</li>
		<li>Use valores transformados a partir da etapa 6 para gerar o gráfico mostrando o valor do TEER e os erros padrão para cada dia de medição do TEER.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Atividade e Análise do Transporte Efflux
NOTA: O ensaio de atividade do transportador Efflux é realizado em uma placa de fundo plano de 24 poços. Os transportadores de interesse da Efflux incluem a ABCB1 e a ABCC1. Recomenda-se que cada condição seja realizada em triplicado com poços de controle (ou seja, poços em branco sem os respectivos inibidores).
<ol><li>Após 48 horas de subcultura (dia 8), incubam células com Valspodar de 10 μM (inibidor ABCB1) ou 10 μM MK571 (inibidor ABCC1) por 1 hora a 37 °C.<ol>
<li>Prepare 10 mM de estoque valspodar dissolvendo 5 mg de pó (1214,64 g/mol) em 412 μL de DMSO e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM Valspodar, misture 10 μL de 10 mM de estoque valspodar com 10 mL de hESFM.</li>
		<li>Prepare 10 mM MK571 de estoque dissolvendo 5 mg de pó (537,07 g/mol) em 931 μL e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM MK571, misture 10 μL de 10 mM MK571 com 10 mL de hESFM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após 1 hora, incubar células com 10 μM de rhodamina 123 (substrato ABCB1) ou 10 μM 2',7'-diclorodihifluoresceína (H2DCFDA, substrato ABCC1) com ou sem seus respectivos inibidores por 1 hora a 37 °C.<ol>
<li>Prepare 10 mM de rhodamina 123 dissolvendo 10 mg de pó (380,82 g/mol) em 875 μL de DMSO e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM de rhodamina 123, misture 10 μL de 10 mM rhodamina 123 estoque com 10 mL de hESFM.</li>
		<li>Prepare 10 mM H2DCFDA dissolvendo 50 mg de pó (487,29 g/mol) em 10,26 mL de DMSO e diluir à concentração de trabalho de 10 μM. Por exemplo, para fazer 10 mL de hESFM com 10 μM de rhodamina 123, misture 10 μL de 10 mM rhodamina 123 estoque com 10 mL de hESFM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as células duas vezes com 0,5 mL de DPBS e lise utilizando DPBS contendo 5% triton-X (v/v).</li>
	<li>Meça fluorescência das células líssedas usando um leitor de várias placas ou microplaca (ver lista de materiais).<ol>
<li>Defina o instrumento do leitor de placas fluorescentes para excitação de 485 nanômetros e 530 nanômetros e meça fluorescência nesses comprimentos de onda.</li>
		<li>Para poços não utilizados no ensaio do transportador, lave as células duas vezes com DPBS antes de corrigi-las com 4% de PFA para quantificação de núcleos celulares.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar células com Hoechst 33342 trihidroclorito trihidrodlorida diluída (1:1000) em DPBS por 10 minutos. Imagem múltiplos campos visuais em cada poço para calcular a contagem média de núcleos celulares usando microscópios de fluorescência.</li>
	<li>Conte núcleos usando Fiji e normalize valores de fluorescência em uma base por célula para essas contagens.<ol>
<li>Calcule o acúmulo médio de fluorescência subtraindo o valor de acumulação de fluorescência bruta para cada condição a partir de seu respectivo valor em branco.</li>
		<li>Valores subtraídos médios para cada condição.</li>
		<li>Divida os valores médios da etapa 9.6.1 pela contagem média de células. Use esses valores para normalizar os valores de fluorescência em uma base por célula.</li>
		<li>Utilize valores normalizados para gerar uma representação gráfica para cada condição inibidora e realizar qualquer análise estatística necessária.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. Troca de passes, expansão e criopreservação de BMECs
<ol><li>Reabastecer as culturas do dia 8 BMEC com hESFM fresco suplementado com B27 diluído (1:200) e permitir que as células se expandam por mais dois dias na matriz COL4/FN.</li>
	<li>Cubra uma nova placa filtrada de 12 Transwell e uma placa de fundo plana de 24 poços com 400 μg/mL COL4 e 100 μg/mL FN e incubar por 4 horas.</li>
	<li>No dia 10, lave as células com DPBS e incuba com 1 mL de EDTA enzimática por pelo menos 15 minutos a 37°C até que uma única suspensão celular seja obtida.</li>
	<li>Coletar células através de centrifugação a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.<ol>
<li>Para criopreservar essas células, resuspend pelotas de células com hESFM fresco com 30% de soro bovino fetal (FBS) e 10% DMSO.</li>
		<li>Armazene BMECs derivados do iPSC em frascos criopreservados em um recipiente isopropanol durante as primeiras 24 horas a -80 °C, em seguida, coloque em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo a -160 °C.</li>
		<li>Para a passagem dessas células, resuspend pelotas de células com hESFM fresco suplementado com diluído (1:200) B27.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Células de sementes em placas revestidas preparadas na etapa 10.2. Células de sementes usando uma razão de 1 poço de uma placa de 6 poços para 3 poços de uma placa filtrada de 12 transwell e para 6 poços de uma placa de 24 poços. Permitir que as células cresçam e se expandam por 24 horas.</li>
	<li>No dia 11, meça o TEER seguindo as etapas listadas na Etapa 8.</li>
	<li>No dia 12, execute o ICC seguindo as etapas listadas na Etapa 9.</li>
	<li>Para descongelar BMECs criopreservados, coloque os frascos criopreservados em uma água morna ou banho de contas a 37oC. Em seguida, transfira os BMECs descongelados para 5 mL de hESFM complementados com B27 diluídos (1:200).<ol>
<li>Coletar células através de centrifugação a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Resuspend as células em hESFM complementadas com diluído (1:200) B27, 10 μM RA e 10 μM Y-27632.</li>
		<li>Após 24 horas, mude de médio para hESFM complementado com diluído (1:200) B27 e 10 μM Y-27632 sem RA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Modificações e solução de problemas
Neste protocolo, fizemos algumas modificações no uso de uma matriz extracelular comumente usada e meios de cultura celular durante a cultura iPSC para derivação de BMECs (Figura 1). Essas mudanças não impactaram a capacidade de derivar BMECS de iPSCs humanos, conforme descrito no protocolo Lippmann1. Uma linha iPSC de um doador saudável diferente foi usada para demonstrar que e...

Função de barreira hemencefálica A barreira hemencefálica (BBB) forma um limite que limita o movimento de substâncias do sangue para o cérebro. O BBB é composto por células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) que formam uma monocamada que reveste a vasculatura. BMECs, juntamente com astrócitos, neurônios, periciosos, microglia e matriz extracelular, formam a unidade neurovascular. Os BMECs possuem uma estrutura paracelular bem regulada que permite ao BBB manter alta resistência elétrica trans-endotelial (TEER), que limita a difusão passiva e serve como indicador de integridade da barreira1,2. Os BMECs também possuem proteínas que auxiliam no movimento transcelular, como endocitose, transcitose e transmigração, bem como extravasação de leucócitos durante uma resposta imune3. Os BMECs contam com transportes de influxo e efflux para nutrição e remoção de resíduos, a fim de manter um equilíbrio homeostático no cérebro3. Por exemplo, a família transportadora solute 2 membro 1 (SLC2A1) é um transportador de fluxo responsável pelo movimento de glicose através do BBB4, enquanto transportadores efflux como o subfamília de de ligação ATP membro B (ABCB1) e o membro C da fita c de ligação ATP 1 (ABCC1) são responsáveis por devolver substratos de volta à corrente sanguínea3,5,6,7. Os substratos ABCB1 incluem morfina, verapamil4e antipsicóticos como olanzapina e risperidona8,enquanto o transportador ABCC1 possui uma variedade de substratos, incluindo conjugados de sulfato, vincristina e conjugados de glucuronídeos4.
Aplicação de Modelos BBB em Transtornos Psiquiátricos A disfunção bbb tem sido implicada em uma série de transtornos neurológicos e psiquiátricos, incluindo esquizofrenia e transtorno bipolar9,10. Recentemente, modelos celulares ex vivo derivados do iPSC estão sendo utilizados para interrogar os fundamentos celulares e moleculares de transtornos psiquiátricos, mas esses modelos atualmente não levam em conta o potencial papel desempenhado pela neurovasculatura11,12,13. É hipótese que citocinas inflamatórias periféricas que circulam no sangue podem impactar negativamente o BBB14,15,16,17, mas também há evidências de paracelular18,19,20,21,122, transcelular23,24,25,26,27,28,29, e matriz extracelular20,29,30,31,32 anormalidades contribuindo para a disfunção BBB. A interrupção do BBB pode resultar no conteúdo do sangue entrando no parenchyma cerebral e ativando astrócitos e/ou microglia para liberar citocinas proinflamatórias, que por sua vez iniciam uma resposta inflamatória33 que pode ter efeitos prejudiciais no cérebro34. Os BMECs são o componente primário do BBB e examinar a estrutura e a função dessas células pode melhorar a compreensão da disfunção BBB em transtornos neurológicos e psiquiátricos.
Modelos alternativos de BMEC Antes do desenvolvimento de protocolos eficientes para o eduque de BMECs dos iPSCs1,6,35,36, os pesquisadores haviam empregado BMECsimortalizados 37 para estudar a função BBB. No entanto, muitos desses modelos não conseguiram alcançar fenótipos BBB desejáveis, uma gama fisiológica de valores TEER38,39. Utilizar iPSCs tem a vantagem de manter o fundo genético do indivíduo do qual as células são derivadas. Os cientistas estão trabalhando ativamente no estabelecimento de modelos de microambiente ex vivo derivados do iPSC que recapitulem a estrutura e a função do cérebro humano. Pesquisadores desenvolveram métodos para derivar BMECs que são estruturalmente e fisiologicamente semelhantes aos BMECs encontrados in vivo. Os métodos para a obtenção de populações purificadas de BMECs derivados do iPSC exigem uma série de etapas diferentes, com protocolos sendo otimizados nos últimos anos1,6,35,36. Geralmente, os BMECs derivados do iPSC são cultivados em meio Essential 6 (E6) por 4 dias, seguidos por 2 dias em meio endotelial-livre de soro humano (hESFM) complementados com fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF), ácido retinóico (RA) e suplemento B27. As células são então cultivadas em uma matriz de colágeno IV (COL4) e fibronectina (FN) para obter >90% BMECs homogêneos1.
A identidade dos BMECs são confirmadas pela imunofluorescência que mostra a co-expressão de proteínas BMEC, incluindo molécula de adesão celular plaquetária-endotelial-1 (PECAM1), SLC2A1 e proteínas de junção apertadas como proteína de junção apertada 1 (TJP1), occludina (OCLN) e claudin-5 (CLDN5)6. Ensaios de broto têm sido usados para confirmar o potencial angiogênico de BMECs derivados do iPSC. 6 A integridade BBB dos BMECs é avaliada pela presença de valores fisiológicos in vitro TEER (~2000Ω x cm2)37 e atividade mensurável para transportadores de efflux como ABCB1 e ABCC11,6,36. Os recentes avanços metodológicos do grupo Lippmann levaram a protocolos BMEC derivados do IPSC com variabilidade experimental reduzida e reprodutibilidade aprimorada1. No entanto, não se sabe se eles podem ser expandidos e passagens para além do estágio de subcultura. Nosso protocolo modificado visa resolver esse problema, aprovando BMECs derivados do iPSC para além do dia 8 e avaliando se eles podem ser expandidos para reter propriedades BBB após a criopreservação. Embora nenhum estudo tenha descrito a passagem de BMECs derivados do iPSC, existe um protocolo para a criopreservação BMEC que retém propriedades fisiológicas do BBB após passar por um ciclo de congelamento40. No entanto, não se sabe se BMECs pós-criopreservação podem ser passagens e reter propriedades BBB.
BMECs derivados de iPSCs usando o protocolo Lippmann têm sido utilizados para modelar a interrupção do BBB em distúrbios neurológicos como a doença de Huntington7. Esses BMECs derivados do iPSC também têm sido usados para investigar os efeitos da infecção bacteriana, como neisseria meningitidis ou Estreptococos do Grupo B na interrupção da barreira hemo-CSF eBBB, respectivamente 41,42. Além disso, usando BMECs derivados do iPSC de pacientes com síndrome de exclusão de 22q com esquizofrenia, os pesquisadores observaram um aumento na molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), uma molécula de adesão importante em BMECs que auxiliam no recrutamento e extravasação de leucócitos no cérebro43. Juntos, esses estudos demonstram a utilidade dos BMECs derivados do iPSC para estudar a interrupção do BBB em distúrbios neuropsiquiátricos complexos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

As células-tronco endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs) podem ser diferenciadas das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSCs) para desenvolver modelos celulares ex vivo para estudar a função de barreira hematoencefálica (BBB). Este protocolo modificado fornece etapas detalhadas para derivar, expandir e criopreservar BMECs de iPSCs humanos usando um doador e reagentes diferentes dos relatados em protocolos anteriores. Os iPSCs são tratados com meio essencial de 6 por 4 dias, seguidos por 2 dias de cultura endotelial-livre de soro humano complementada com fator básico de crescimento do fibroblasto, ácido retinóico e suplemento B27. No dia 6, as células são subculturadas em uma matriz de colágeno/fibronectina por 2 dias. A imunocitoquímica é realizada no dia 8 para análise de marcadores BMEC utilizando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 e SLC2A1. A mancha ocidental é realizada para confirmar a expressão do marcador BMEC, e a ausência de SOX17, um marcador endodérmico. O potencial angiogênico é demonstrado com um ensaio brotante. A resistência elétrica trans-endotelial (TEER) é medida usando eletrodos de pauzinho e voltohmômetro a partir do dia 7. A atividade de transporte da Efflux para o membro B da subfamília de fita 1 e atp de ligação c membro 1 é medida usando um leitor de várias placas no dia 8. A derivação bem sucedida de BMECs é confirmada pela presença de marcadores celulares relevantes, baixos níveis de SOX17, potencial angiogênico, atividade de transporte e valores TEER ~2000 Ω x cm2. Os BMECs são expandidos até o dia 10 antes de passar para placas de colágeno/fibronectina recém-revestidas ou criopreservadas. Este protocolo demonstra que os BMECs derivados do iPSC podem ser expandidos e passagens pelo menos uma vez. No entanto, foram observados valores de TEER mais baixos e pior localização dos marcadores BMEC após a criopreservação. Os BMECs podem ser utilizados em experimentos de co-cultura com outros tipos de células (neurônios, glia, pericytes), em modelos cerebrais tridimensionais (organ-chip e hidrogel), para vascularização de organoides cerebrais, e para estudar a disfunção BBB em distúrbios neuropsiquiátricos.

Diferenciação BMEC Alguns passos críticos neste protocolo devem ser seguidos com precisão(Figura 1). O uso médio do E6 no dia 1 é importante, uma vez que é frequentemente usado para obter linhagem neuroectoderme de iPSCs dentro de um período relativamente curto de tempo produzindo resultados reprodutíveis em múltiplas linhas celulares36. Outro passo importante é no dia 4 de diferenciação, onde o meio E6 deve ser trocado para hESFM com ...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Este protocolo detalha um método adaptado para derivar, expandir e criopreservar células microvasculares microvasculares cerebrais obtidas pela diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e para estudar as propriedades da barreira cerebral no sangue em um modelo ex vivo.

Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

derivation-expansion-cryopreservation-characterization-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.2K visualizações.  Massachusetts General Hospital. Este protocolo detalha um método adaptado para derivar, expandir e criopreservar células microvasculares microvasculares cerebrais obtidas pela diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e para estudar as propriedades da barreira cerebral no sangue em um modelo ex vivo.

Vídeo: Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Neurociência

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Um Método de Expansão cGMP-aplicável para Agregados de Neural Humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolamento de células endoteliais Microvascular do principal músculo esquelético murino

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Geração de neurônios humanos e oligodendrócitos a partir de células-tronco pluripotentes para modelagem de interações neurônio-oligodendrócitos

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...