Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü KL2 TR002542 (PL) olan Yenilikçi Yeni Bilim İnsanları için Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü Biyobehavioral Araştırma Ödülleri R01MH113858 (R.K.'ye) tarafından desteklendi. Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü Klinik Bilimci Geliştirme Ödülü K08MH086846 (R.K.'ye), Sydney R Baer Jr Vakfı Hibesi (P.L.'ye) Doris Duke Hayır Kurumu Klinik Bilimci Geliştirme Ödülü (R.K.'ye), Ryan Licht Sang Bipolar Vakfı (R.K.'ye), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Vakfı (R.K.'ye), Harvard Kök Hücre Enstitüsü (R.K.'ye) ve Steve Willis ve Elissa Freud (R.K.'ye). Dr. Annie Kathuria'ya makale hakkındaki eleştirel okumaları ve geri bildirimleri için teşekkür ederiz.

İnsan iPSC'leri, Massachusetts Genel Hastanesi ve McLean Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylanan bir protokol kullanılarak sağlıklı donörlerin fibroblastlarından yeniden programlandı ve önceki çalışmalarda açıklandığı gibi karakterize edildi44,45,46.
NOT: Kısaca, fibroblastlar mRNA tabanlı genetik yeniden programlama ile iPSC'ye yeniden programlandı47. IPSC'ler kök hücre ortamında (SCM) muhafaza edildi (malzeme listesine bakın) ve 1 mL SCM ile ~1.2 x10 2 hücre/ mL yoğunluğunda depolandı, -160 °C'de sıvı nitrojende kriyoprezor olarak korunan şişelerde eşkenar dörtgen ilişkili protein kinaz inhibitörü (ROCKi) Y-27632 ve %10 (v/v) dimetil sülfit (DMSO) ile 10 μM. Aşağıdaki işlemlerin tümü, aksi belirtilmedikçe bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.
1. Bodrum membran matrisi seyreltme ve plaka kaplaması
<ol><li>Seyreltik (1:50) büyüme faktörü, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası'ndaki (DMEM) Engelbreth-Holm-Swarm tümöründen fenol kırmızısı olmadan saflaştırılmış bodrum membran matrisini azalttı.</li>
	<li>Uygun miktarda seyreltilmiş bodrum membran matrisi (yani, 6 kuyu plakası = 1mL, 12 kuyu plakası = 0,5 mL) ile hücre kültürü plakalarını kaplayın ve bu plakaları en az 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>2. iPSC bakımı
NOT: 6 kuyu düz tabanlı bir plakada kuyu başına maksimum izdiah ~ 1,2 x 106 hücredir.
<ol><li>Cryopreserved iPSC'leri 10 μM Y-27632 ile SCM'ye çözün ve plakayı seyreltilmiş büyüme faktörü azaltılmış bodrum membran matrisi ile kaplanmış 6 kuyulu bir plakaya koyun.</li>
	<li>Çözülmeden sonraki ilk 24 saat boyunca 10 μM Y-27632 ile SCM'de iPSC'leri koruyun. 24 saat sonra taze ortama geçin.</li>
	<li>Hücreler geçmeden önce %80-90 izdiah edene kadar IPSC'leri SCM'de saklayın.<ol>
<li>Farklılaşma için istenen yoğunluğu (15.600 hücre/cm2)kuyunun yüzey alanıyla çarparak farklılaşma için kaç iPSC'ye ihtiyaç duyulacağını hesaplayın. 6 kuyulu düz-alt plaka için, toplam 149.760 hücre / kuyu için 15.600 hücre / cm 2 ile 9.6 cm2'yi çarpın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geçiş yapmak için hücreleri Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBBS) ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca enzymatic olmayan etilenediaminetetraasetik asit (EDTA) (malzeme listesine bakın) ile kuluçkaya yatırın.<ol>
<li>Hücreleri yavaşça kaldırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Hücreleri taze SCM'de toplayın.</li>
		<li>Hücreleri seyreltilmiş SCM ile kaplanmış hücre kültürü plakalarına koyun ve hücreleri adım 2.3'te açıklandığı gibi tutun veya 1 mL SCM'de ~1.2 x10 6 hücre/mL, 10 μM Y-27632 ve %10 DMSO (v/v) sıvı nitrojendeki sıvı nitrojendeki şişelerde -160 °C sıcaklıkta saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IPSC'lerin BMEC'lere Farklılaştırılması
NOT: Enzymatic olmayan EDTA hücreleri kümelere ayırır. Enzymatic EDTA (bkz. Malzeme Tablosu)hücreleri tek hücreli süspansiyona ayırır. Retinoik asit (RA) ışıktan korunmalıdır.
<ol><li>IPSC'leri Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salin 'i (DPBS) ile bir kez yıkayın. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 37 °C'de yaklaşık 5 dakika boyunca enzymatic EDTA (6 kuyu plakası için 1 mL, 12 kuyu plakası için 0,5 mL ve 24 kuyu plakası için 0,25 mL) ile kuluçkalayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da (göreceli santrifüj kuvveti) hücreleri ve santrifüjleri toplayın. SCM'de 10 μM Y-27632 içeren hücre peletlerini yeniden salım.</li>
	<li>Trypan Blue ve otomatik hücre sayacı veya hemositometre cihazı kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin. 24 saat boyunca 10 μMY-27632 içeren SCM'de 6 kuyulu düz tabanlı plakanın (9,6 cm2/kuyuyüzey alanına sahip) 15.600 hücre/cm 2 veya 149.760 hücre/kuyu yoğunluğunda plaka hücreleri.</li>
	<li>SCM'yi E6 ortamına değiştirerek 24 saat sonra farklılaşmayı başlatın. Önümüzdeki 4 gün boyunca E6 ortamını günlük olarak değiştirin.</li>
	<li>Farklılaşmanın 4. gününde, E6 ortamını seyreltilmiş (1:200) B27 takviyesi, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM RA ile desteklenmiş hESFM ile değiştirin. Önümüzdeki 48 saat boyunca bu ortamı değiştirmeyin.</li>
	<li>Seyreltilmiş (1:200) B27 ile 200 mL hESFM hazırlayın, 199 mL hESFM'ye 1 mL konsantre B27 takviyesi karıştırın.</li>
	<li>200 μg/mL stok çözümü yapmak için 250 μL Tris tamponunda (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) 50 μg bFGF yeniden inşa ederek 20 ng/mL bFGF hazırlayın. 200 mL 200 μg/mL bFGF'yi 200 mL hESFM ile karıştırarak 20 ng/mL bFGF içeren 200 mL hESFM hazırlayın.</li>
	<li>100 mg RA tozunu 2,5 mL DMSO ekleyerek önce 40 mg/mL RA stok çözeltisi yaparak 10 μM RA hazırlayın. 10 mM stok çözeltisi yapmak için bu konsantrasyonu 3 mg / mL'ye seyreltin. 200 mL hESFM'de 200 μL 10μM RA'yı karıştırarak 10 μM RA içeren 200 mL hESFM hazırlayın.</li>
</ol>4. iPSC Türevi BMEC'in Saflaştırılması için kollajen IV (COL4) ve fibronektin (FN) Matrisini kaplama
<ol><li>1 mg/mL FN stok çözeltisi yapmak için 2 mg FN'ye 2 mL steril su ekleyin. 1 mg/mL COL4 stok çözeltisi yapmak için 5 mg COL4'e 5 mL steril su ekleyin.<ol>
<li>FN'nin 37 °C'de en az 30 dakika, COL4'ün ise oda sıcaklığında çözülmesine izin verin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FN stok çözeltisini steril suda 100 μg/mL'lik son konsantrasyona ve COL4 stok çözeltisini 400 μg/mL'lik son konsantrasyona seyreltin.</li>
	<li>İstenilen plakaları (6 kuyulu plaka = 1 mL COL4/FN çözeltisi, 12 kuyu plakası = 0,5 mL, 24 kuyu plakası= 0,25 mL ve 12 transwell filtreli plaka = 0,25 mL) 400 μg/mL COL4 ve 100 μg/mL FN karışımı ile kaplayın.</li>
	<li>Plakaları en az 2 saat veya 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın; Transwell filtreli plakalar için en az 4 saat önerilir.</li>
</ol>5. iPSC Türevli BMEC'lerin alt kültürü ve saflaştırılması
NOT: Enzymatic EDTA ile inkübasyon, farklılaşmanın 6. gününde hücrelerin birleştiği güne bağlı olarak 15 dakikadan uzun sürebilir.
<ol><li>Farklılaşmanın 6. gününde hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. Tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar 37 °C'de en az 15 dakika 1 mL enzimatik EDTA ile kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla hücreleri toplayın. Seyreltilmiş (1:200) B27 takviyesi, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM RA ile taze hESFM ile hücre peletlerini yeniden söyün.</li>
	<li>400 μg/mL COL4 ve 100 μg/mL FN karışımı ile kaplanmış plakalara tohum hücreleri, 6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusu ile 12 kuyulu bir plakanın 3 kuyusu, 12 transwell filtreli plakanın 3 kuyusu veya 24 kuyulu bir plakanın 6 kuyusunun oranı kullanılarak tohum hücreleri.</li>
	<li>Aynı hücre hattından COL4/FN kaplı 12 transwell filtreli plakaya TEER analizi için negatif kontrol olarak tohum farklılaşmamış iPSC'ler.</li>
	<li>24 saatlik alt kültlemeden sonra, ortamı yalnızca B27 takviyesi ile hESFM olarak değiştirin. Bu adımdan sonra orta değişiklik gerekmez.</li>
</ol>6. Filizlenen tahlil
<ol><li>8. Gün iPSC türevi BMEC'leri toplayın ve bunları 100.000 hücre/kuyuda, 200 μL/cm 2 bodrum membran matrisi ile yeni kaplanmış24 kuyulu düz tabanlı bir tabağa tohumlayın.</li>
	<li>Bu hücreleri hESFM ile seyreltilmiş (1:200) B27 ve 40 ng/mL vasküler endotel büyüme faktörü A (VEGFA165) ile tedavi edin.</li>
	<li>Her 24 saatte bir hücreleri gözlemleyin ve ortamı her iki günde bir değiştirin.</li>
</ol>7. İmmünostokimya (ICC)
NOT: ICC, 24 kuyulu düz tabanlı plakalarda gerçekleştirilir.
<ol><li>48 saatlik alt kültlemeden sonra (8. gün), hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. %4 paraformaldehit (PFA) içeren hücreleri 20 dakika boyunca sabitleyin.</li>
	<li>Hücreleri DPBS ile üç kez yıkayın, yıkama başına 5 dakika. DPBS'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 eşek serumu ve %0,3 Triton X-100 (v/v) ile ön blok hücreler.</li>
	<li>Birincil antikorlarla kuluçkaya yaslanın: fare anti-insan-PECAM1 (1:100, stok 0,5 mg/mL), tavşan anti-insan-TJP1 (1:200, stok 0,53 mg/mL), fare anti-insan-CLDN5 (1:200, 4°C'de gece boyunca %5 eşek serumu içeren DPBS'de stok 0,5 mg/mL), fare anti-insan-OCLN (1:200, stok 0,5 mg/mL) ve tavşan anti-insan-SLC2A1 (1:100, stok 0,2 mg/mL).<ol>
<li>Hücreleri DPBS ile bir kez durulayın ve ardından DPBS ile yıkama başına 5 dakika boyunca beş kez yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İkincil antikorlarla hücreleri kuluçkaya bırakın: eşek-anti-tavşan Alexa Fluor 555 (1:200) ve eşek-fare karşıtı 488 (1:200) DPBS'de 1 saat boyunca% 5 eşek serumu içerir.</li>
	<li>Bu inkübasyonu takiben, 10 dakika boyunca DPBS'de seyreltilmiş (1:1000) Hoechst 33342 trihidrochloride trihidrat ekleyin.<ol>
<li>Hoechst 33342 solüsyonünü çıkarın ve DPBS ile bir kez durulayın ve yıkama başına 5 dakika boyunca DPBS ile dört kez yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre üreticilerinin ifadesini ve lokalizasyonunu aramak için floresan mikroskoplardaki hücreleri görselleştirin.</li>
</ol>8. TEER Ölçüm ve Analizi
NOT: Corning 12-Transwell filtreli plakalar 1,12 cm2 polietilen tereftalat membran ve 0,4 mikrometre gözenekten oluşan filtrelerle donatılmıştır. TEER ölçümleri teknik (kuyu başına 3) ve biyolojik çoğaltmalarda (hücre hattı ve/veya durum başına 3 kuyu) elde edilir.
<ol><li>Alt kültlemeden 24 saat sonra (7. gün), her 24 saatte bir çubuk elektrotları ve bir voltohmmetre kullanarak TEER'i ölçün. Ölçümlerin eldeine ilişkin özel talimatlar için voltohmmeter kullanım kılavuzuna bakın.<ol>
<li>TEER'i ölçmek için voltohmmeter aletini bir gece önce şarj edin. Aleti ve çubuk elektrotları emniyet başlığına yerleştirmeden önce% 70 etanol ile hafifçe silin.</li>
		<li>Gücü kapatın ve ohm ölçüm cihazını üreticinin önerdiği şekilde kalibre edin.</li>
		<li>Yemek çubuğu elektrotlarını takın ve elektrotları% 70 etanol ile durulayın ve ardından DPBS.</li>
		<li>Daha kısa uç elektrodu trans-kuyu kesici ucuna (apikal oda) ve daha uzun ucu bazolateral odaya yerleştirin.</li>
		<li>öncelikle yalnızca COL4/FN ile kaplanmış boş bir kuyuyu ölçün. O zaman diğer kuyuları ölç.</li>
		<li>Farklı koşulları ölçerken (yani farklı hücre hatlarını ölçerken) yemek çubuğu elektrotlarını %70 etanol ve ardından DPBS ile hızlı bir şekilde durulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm ölçümler kaydedildikten sonra (Ω), çubuk elektrotları% 70 etanol ve ardından steril su ile durulayın. Elektrotu hafifçe silin ve emniyet kaputunda havanın kurumasına izin verin.</li>
	<li>Boş kuyudan üç taraflı TEER değerlerini (Ω olarak) ortalama ve bu ortalama değeri her ham TEER değerinden koşula göre çıkarın.<ol>
<li>Çıkarılan değerlerin ortalamasını elde edin ve bunları 1,12 cm2 (12 transwell kesici ucun yüzey alanı) ile çarpın.</li>
		<li>TEER değerini ve TEER ölçümünün her günü için standart hataları gösteren grafiği oluşturmak için 6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Efflux Transporter Aktivitesi ve Analizi
NOT: Efflux taşıyıcı aktivite tahlili 24 kuyulu düz tabanlı bir plaka üzerinde gerçekleştirilir. İlgi çekici Efflux taşıyıcıları arasında ABCB1 ve ABCC1 bulunmaktadır. Her durumun kontrol kuyuları (yani ilgili inhibitörler olmadan boş kuyular) ile üç taraflı olarak yapılması önerilir.
<ol><li>48 saatlik alt kültlemeden sonra (8. gün), hücreleri 37 °C'de 1 saat boyunca 10 μM Valspodar (ABCB1 inhibitörü) veya 10 μM MK571 (ABCC1 inhibitörü) ile kuluçkaya yatırın.<ol>
<li>412 μL DMSO'da 5 mg toz (1214,64 g/mol) eriterek 10 mM Valspodar stoğu hazırlayın ve 10 μM çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Örneğin, 10 μM Valspodar ile 10 mL hESFM yapmak için, 10 μL 10 mM Valspodar stoğunu 10 mL hESFM ile karıştırın.</li>
		<li>931 μL'de 5 mg tozu (537,07 g/mol) eriterek 10 mM MK571 stoğu hazırlayın ve 10 μM çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Örneğin, 10 μM MK571 ile 10 mL hESFM yapmak için, 10 mM MK571 stoğun 10 μL'si ile 10 mL hESFM karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 saat sonra, 10 μM rhodamin 123 (ABCB1 substrat) veya 10 μM 2',7'-diklorodihydrofluorescein diasetat (H2DCFDA, ABCC1 substrat) ile hücreleri 37 °C'de 1 saat boyunca inhibitörleri ile veya olmadan kuluçkaya yatırın.<ol>
<li>875 μL DMSO'da 10 mg toz (380,82 g/mol) eriterek 10 mM rhodamin 123 hazırlayın ve 10 μM çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Örneğin, 10 μM rhodamin 123 ile 10 mL hESFM yapmak için, 10 mM rhodamin 123 stoğunun 10 μL'si ile 10 mL hESFM karıştırın.</li>
		<li>10,26 mL DMSO'da 50 mg toz (487,29 g/mol) eriterek 10 mM H2DCFDA hazırlayın ve 10 μM çalışma konsantrasyonuna seyreltin. Örneğin, 10 μM rhodamin 123 ile 10 mL hESFM yapmak için, 10 mM rhodamin 123 stoğunun 10 μL'si ile 10 mL hESFM karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>%5 Triton-X (v/v) içeren DPBS kullanarak hücreleri 0,5 mL DPBS ve lyse ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Çok plakalı veya mikro plaka okuyucu kullanarak katlanmış hücrelerin floresanını ölçün (malzeme listesine bakın).<ol>
<li>Floresan plaka okuyucu aletini 485 nanometre ekscitasyon ve 530 nanometre emisyonu olarak ayarlayın ve bu dalga boylarında floresan ölçümü yapın.</li>
		<li>Işınlayıcı testinde kullanılmayan kuyular için, hücreleri hücre çekirdeği nicelemesi için% 4 PFA ile sabitlemeden önce DPBS ile iki kez yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri Hoechst 33342 trihidroklorür trihidrat ile DPBS'de 10 dakika boyunca seyreltilmiş (1:1000) kuluçkaya yatır. Floresan mikroskoplar kullanarak ortalama hücre çekirdeği sayılarını hesaplamak için her kuyuda birden fazla görsel alan görüntüleyin.</li>
	<li>Fiji kullanarak çekirdekleri sayın ve floresan değerlerini hücre başına bu sayımlara göre normalleştirin.<ol>
<li>Her koşul için ham floresan biriktirme değerini ilgili boş değerinden çıkararak ortalama floresan birikimini hesaplayın.</li>
		<li>Her koşul için ortalama çıkarılan değerler.</li>
		<li>Ortalama değerleri adım 9.6.1'den ortalama hücre sayısına bölün. Floresan değerlerini hücre bazında normalleştirmek için bu değerleri kullanın.</li>
		<li>Her inhibitör durumu için grafiksel bir gösterim oluşturmak ve gerekli istatistiksel analizleri gerçekleştirmek için normalleştirilmiş değerleri kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. BMEC'leri Geçirme, Genişletme ve Kriyoprezitan
<ol><li>Seyreltilmiş (1:200) B27 ile desteklenmiş taze hESFM ile 8 BMEC kültürünü yenileyin ve hücrelerin COL4 /FN matrisinde iki gün daha genişlemesine izin verin.</li>
	<li>Yeni bir 12-Transwell filtreli plakayı ve 400 μg/mL COL4 ve 100 μg/mL FN ile 24 kuyulu düz tabanlı bir plakayı kapla ve 4 saat kuluçkaya yatır.</li>
	<li>10. günde, hücreleri DPBS ile yıkayın ve tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar 37 °C'de en az 15 dakika boyunca 1 mL enzimatik EDTA ile kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla hücreleri toplayın.<ol>
<li>Bu hücreleri kriyopreserve etmek için% 30 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve% 10 DMSO ile taze hESFM ile hücre peletlerini yeniden biriktirin.</li>
		<li>iPSC türevli BMEC'leri kriyoprezerkasyonlu şişelerde -80 °C'de ilk 24 saat boyunca bir izopropanol kabında saklayın, ardından -160 °C'de uzun süreli depolama için sıvı nitrojene yerleştirin.</li>
		<li>Bu hücreleri geçirmek için, seyreltilmiş (1:200) B27 ile desteklenmiş taze hESFM ile hücre peletlerini yeniden biriktirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adım 10.2'de hazırlanan kaplamalı plakalara tohum hücreleri. 6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusunun 12 transwell filtreli plakanın 3 kuyusuna ve 24 kuyulu bir plakanın 6 kuyusuna oranını kullanan tohum hücreleri. Hücrelerin 24 saat boyunca büyümesine ve genişlemesine izin verin.</li>
	<li>11. günde, Adım 8'de listelenen adımları izleyerek TEER'i ölçün.</li>
	<li>12. günde, Adım 9'da listelenen adımları izleyerek ICC gerçekleştirin.</li>
	<li>Kriyoprezer korunmuş BMEC'leri eritmek için, kriyoprezerserved şişeleri 37 o C'de ılık bir suya veya boncukbanyosuna yerleştirin. Daha sonra çözülmüş BMEC'leri seyreltilmiş (1:200) B27 ile birlikte 5 mL hESFM'ye aktarın.<ol>
<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleme yoluyla hücreleri toplayın. Seyreltilmiş (1:200) B27, 10 μM RA ve 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş hESFM'deki hücreleri yeniden biriktirin.</li>
		<li>24 saat sonra, RA olmadan seyreltilmiş (1:200) B27 ve 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş orta ila hESFM'ye geçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Değişiklikler ve Sorun Giderme
Bu protokolde, BMEC'lerin türetimi için iPSC kültürü sırasında yaygın olarak kullanılan hücre dışı matris ve hücre kültürü medyasının kullanılmasında bazı değişiklikler yaptık (Şekil 1). Bu değişiklikler, Lippmann protokolünde açıklandığı gibi bmecs'i insan iPSC'lerinden türetme yeteneğini etkilemedi1. Bu değiştirilmiş protokolün diğer satırlarla ön...

Kan-Beyin Bariyer fonksiyonu Kan-beyin bariyeri (BBB), maddelerin kandan beyne hareketini sınırlayan bir sınır oluşturur. BBB, vaskülat astarlı bir monolayer oluşturan beyin mikrovasküler endotel hücrelerinden (VPC' ler) oluşur. BMEC'ler, astrositler, nöronlar, perisitler, mikroglia ve hücre dışı matris ile birlikte nörovasküler üniteyi oluşturur. BMEC'ler, BBB'nin pasif difüzyonu sınırlayan ve bariyer bütünlüğünün bir göstergesi olarak hizmet eden yüksek trans-endotel elektrik direncini (TEER) korumasını sağlayan sıkı bir şekilde düzenlenmiş parasellüler yapıya sahiptir1,2. BMEC'ler ayrıca endositoz, transsitoz ve transmigrasyon gibi hücrelerarası hareketin yanı sıra immün yanıt sırasında lökositlerin ekstravazasyonuna yardımcı olan proteinlere sahiptir3. BMEC'ler, beyinde homeostatik bir dengeyi korumak için atık ürünlerin beslenmesi ve uzaklaştırılması için akın ve efflux taşıyıcılarınagüvenir 3. Örneğin, solute taşıyıcı ailesi 2 üye 1 (SLC2A1), Glikozun BBB4boyunca hareketinden sorumlu bir akın taşıyıcısıdır, ATP bağlama kaseti alt ailesi gibi efflux taşıyıcıları ise B üye 1 (ABCB1) ve ATP bağlama kaseti alt familyası C üye 1 (ABCC1), substratları kan akışına geri döndürmekten sorumludur3,5,6,7. ABCB1 substratları morfin, verapamil4ve olanzapine ve risperidone8gibi antipsikotikleri içerirken, ABCC1 taşıyıcısı sülfat konjugeleri, vincristine ve glucuronide konjugeleri4dahil olmak üzere çeşitli substratlara sahiptir.
Psikiyatrik Bozukluklarda BBB Modellerinin Uygulanması BBB disfonksiyonu, şizofreni ve bipolar bozukluk9,10dahil olmak üzere bir dizi nörolojik ve psikiyatrik rahatsızlığa karışmıştır. Son zamanlarda, psikiyatrik bozuklukların hücresel ve moleküler temellerini sorgulamak için iPSC türevli ex vivo hücresel modeller kullanılmaktadır, ancak bu modeller şu anda nörovasküler11 , 12,13tarafından oynanan potansiyel rolü dikkate almamaktadır. Kanda dolaşan periferik inflamatuar sitokinlerin BBB14 , 15,16,17'yi olumsuz yönde etkileyebileceği varsayılmaktadır, ancak paraselüler18 , 19,20,21,21için de kanıtlarvardır.22, hücreler arası23,24,25,26,27,28,29ve hücre dışı matris20,29,30,31,BBB disfonksiyona katkıda bulunan32 anormallik. BBB'nin bozulması, kanın içeriğinin beyin parenkimine girmesine ve proinflamatuar sitokinleri serbest bırakmak için astrositleri ve / veya mikrogliayı aktive etmesine neden olabilir, bu da beyin üzerinde zararlı etkileri olabilecek enflamatuar bir yanıt33 başlatır34. BMEC'ler BBB'nin birincil bileşenidir ve bu hücrelerin yapısının ve işlevinin incelenmesi nörolojik ve psikiyatrik bozukluklarda BBB disfonksiyonunun anlaşılmasını artırabilir.
Alternatif BMEC Modelleri IPSC 1 , 6 , 35,36'danBMEC'leri türetmek için etkili protokollerin geliştirilmesindenönce,araştırmacılar BBB işlevini incelemek için ölümsüzleştirilmiş BMEC37'yi çalıştırmışlardı. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu istenen BBB fenotiplerine ulaşamadı, böyle bir fizyolojik TEER değerleri aralığı38,39. IPSC'lerin kullanılması, hücrelerin türetildiği bireyin genetik arka planını koruma avantajına sahiptir. Bilim adamları, insan beyninin yapısını ve işlevini yeniden sağlayan iPSC türevi ex vivo mikroçevronment modelleri oluşturmak için aktif olarak çalışıyorlar. Araştırmacılar, yapısal ve fizyolojik olarak in vivo bulunan BMEC'lere benzeyen BMEC'leri türetmek için yöntemler geliştirmiştir. iPSC türevi BMEC'lerin saflaştırılmış popülasyonlarını elde etmek için yöntemler, son birkaç yılda optimize edilen protokollerle bir dizi farklı adım gerektirir1,6,35,36. Genellikle, iPSC türevi BMEC'ler Essential 6 (E6) ortamında 4 gün boyunca kültürlenir, ardından temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), retinoik asit (RA) ve B27 takviyesi ile desteklenmiş insan endotel serumsuz ortamında (hESFM) 2 gün kültürlenir. Hücreler daha sonra bir kollajen IV (COL4) ve fibronektin (FN) matrisi üzerinde kültürlenir ve >% 90 homojen BMEC1elde edilir.
VPC'lerin kimliği, trombosit-endotel hücre yapışma molekülü-1 (PECAM1), SLC2A1 ve sıkı kavşak proteini 1 (TJP1), occludin (OCLN) ve claudin-5 (CLDN5)6gibi sıkı kavşak proteinleri de dahil olmak üzere BMEC proteinlerinin birlikte ekspresyonunu gösteren immünoresans ile doğrulanır. Filizlenen tahliller, iPSC türevli VPC'lerin anjiyojenik potansiyelini doğrulamak için kullanılmıştır. 6 BMEC'lerin BBB bütünlüğü, fizyolojik in vitro TEER değerlerinin (~2000Ω x cm2)37 varlığı ve ABCB1 ve ABCC11,6,36gibi efflux taşıyıcıları için ölçülebilir aktivite ile değerlendirilir. Lippmann grubunun son metodolojik gelişmeleri, deneysel değişkenliği azaltılmış ve tekrarlanabilirliği artırılmış iPSC türevi BMEC protokollerine yol açmıştır1. Bununla birlikte, alt kültleme aşamasının ötesine genişletilip geçilemeyecekleri bilinmemektedir. Değiştirilmiş protokolümüz, iPSC türevi BMEC'leri 8. Hiçbir çalışma iPSC türevi BMEC'lerin geçtiğini açıklamamakla birlikte, bmec kriyoprezervasyonu için donma-çözülme döngüsünden geçtikten sonra fizyolojik BBB özelliklerini koruyan bir protokolvardır 40. Bununla birlikte, kriyoprezervasyon sonrası BMEC'lerin geçebileceği ve BBB özelliklerini koruyabileceği bilinmemektedir.
Lippmann protokolünü kullanan iPSC'lerden türetilen BMEC'ler Huntington hastalığı7gibi nörolojik bozukluklarda BBB bozulmasını modellemek için kullanılmıştır. Bu tür iPSC türevli BMEC'ler, Neisseria meningitidis veya B Grubu Streptococcus gibi bakteriyel enfeksiyonun kan-CSF bariyerinin ve BBB'nin bozulması üzerindeki etkilerini araştırmak için dekullanılmıştır. Ayrıca, şizofrenili 22q delesyon sendromu hastalarından iPSC türevi BMEC'ler kullanan araştırmacılar, LÖK'lerde lökositlerin beyne alınmasına ve ekstravazasyonuna yardımcı olan önemli bir yapışma molekülü olan hücreler arası yapışma molekülü-1'de (ICAM-1) bir artış gözlemlediler43. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar karmaşık nöropsikiyatrik bozukluklarda BBB bozulmasını incelemek için iPSC türevi BMEC'lerin yararını göstermektedir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (VPC'ler), kan-beyin bariyeri (BBB) fonksiyonunu incelemek için ex vivo hücresel modeller geliştirmek için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC' ler) ayırt edilebilir. Bu değiştirilmiş protokol, önceki protokollerde bildirilenlerden farklı bir donör ve reaktif kullanarak insan iPSC'lerinden BMEC'leri türetmek, genişletmek ve kriyoprezerk için ayrıntılı adımlar sağlar. iPSC'ler 4 gün boyunca esansiyel 6 ortam ile tedavi edilir, ardından temel fibroblast büyüme faktörü, retinoik asit ve B27 takviyesi ile desteklenmiş 2 günlük insan endotel serumsuz kültür ortamı ile tedavi edilir. 6. günde, hücreler 2 gün boyunca bir kollajen / fibronektin matrisi üzerine alt kültürlenir. İmmünostokimya, CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 ve SLC2A1 kullanılarak BMEC belirteç analizi için 8. Batı blotting, BMEC işaretleyici ifadesini ve endodermal bir işaretleyici olan SOX17'nin yokluğunu onaylamak için gerçekleştirilir. Anjiyojenik potansiyel filizlenen bir test ile gösterilmiştir. Trans-endotel elektrik direnci (TEER), 7. günden itibaren çubuk elektrotlar ve voltohmmetre kullanılarak ölçülür. ATP bağlama kaseti alt familyası B üye 1 ve ATP bağlama kaseti alt familyası C üye 1 için efflux taşıyıcı etkinliği 8. günde çok plakalı okuyucu kullanılarak ölçülür. BMEC'lerin başarılı türemesi, ilgili hücre belirteçlerinin varlığı, düşük SOX17 seviyeleri, anjiyojenik potansiyel, taşıyıcı aktivitesi ve TEER değerlerinin ~2000 Ω x cm2varlığı ile doğrulanır. BMEC'ler, taze kaplanmış kollajen/ fibronektin plakalarına geçmeden veya kriyoprezserved olmadan önce 10 güne kadar genişletilir. Bu protokol, iPSC türevli BMEC'lerin en az bir kez genişletilebileceğini ve geçebileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyondan sonra daha düşük TEER değerleri ve BMEC işaretleyicilerinin daha zayıf lokalizasyonu gözlenmiştir. BMEC'ler diğer hücre tipleriyle (nöronlar, glialar, perisitler) ortak kültürdeneylerinde, üç boyutlu beyin modellerinde (organ çipi ve hidrojel), beyin organoidlerinin damarlanması ve nöropsikiyatrik bozukluklarda BBB disfonksiyonunun incelenmesi için kullanılabilir.

BMEC Farklılaşması Bu protokoldeki birkaç kritik adım tam olarak takip edilmelidir (Şekil 1). 1. günde E6 orta kullanımı önemlidir, çünkü genellikle birden fazla hücre hattında tekrarlanabilir sonuçlar veren nispeten kısa bir süre içinde iPSC'lerden nöroektoderm soyu türetmek için kullanılır36. Bir diğer önemli adım, E6 ortamının seyreltilmiş (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF ve 10 μM RA ile iPSC türevi BMEC'leri genişletm...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin ayırt edilmesiyle elde edilen beyin mikrovasküler endotel hücrelerini türetmek, genişletmek ve kriyoprezerserve etmek ve bir ex vivo modelde kan beyin bariyeri özelliklerini incelemek için uyarlanmış bir yöntemi detaylandırmaktadır.

İnsan İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin Derivasyonu, Genişlemesi, Kriyoprezervasyonu ve Karakterizasyonu

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

derivation-expansion-cryopreservation-characterization-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.2K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital. Bu protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin ayırt edilmesiyle elde edilen beyin mikrovasküler endotel hücrelerini türetmek, genişletmek ve kriyoprezerserve etmek ve bir ex vivo modelde kan beyin bariyeri özelliklerini incelemek için uyarlanmış bir yöntemi detaylandırmaktadır.

Video: Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Nörobilim

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

İnsan Nöral Agregalarının bir cGMP uygulanabilir Açılım Yöntemi kök hücrelerin pluripotent kök hücreleri veya Fetal Beyin dokusundan türetilen

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...