この研究は、国立精神衛生研究所の新しい科学者のためのバイオビヘイビア研究賞(BRAINS)賞R01MH113858(R.K.へ)、国立衛生研究所賞KL2 TR002542(PL)によってサポートされました。国立精神衛生研究所臨床科学者開発賞K08MH086846(R.K.へ)、シドニーRベアJr財団グラント(P.L.)ドリスデューク慈善財団臨床科学者開発賞(R.K.)、ライアン・リヒト・サン・バイポーラ財団(R.K.)、フィリス&amp; ジェローム・ライル・ラッパポート財団(R.K.)、ハーバード幹細胞研究所(R.K.へ)、スティーブ・ウィリスとエリッサ・フロイト(R.K.へ)。私たちは、彼女の批判的な読書と原稿に関するフィードバックのためにアニー・カトゥリア博士に感謝します。

ヒトiPSCは、マサチューセッツ総合病院およびマクリーン病院の機関審査委員会によって承認されたプロトコルを使用して健康なドナーの線維芽細胞から再プログラムされ、以前の研究44、45、46に記載されているように特徴付けられる。
注:簡単に言えば、線維芽細胞は、mRNAベースの遺伝的リプログラミング47を介してiPSCに再プログラムされた。iPSCは幹細胞培地(SCM)(材料リストを参照)で維持され、SCMの1mLで〜1.2 x 102 細胞/mLの密度で保存され、Rho関連プロテインキナーゼ阻害剤(ROCKi)Y-27632、および10%(v/v)ジメチル硫化物(DMSO)を有する10%(v/v)ジメチル硫化物(DMSO)を有する10%(v/v)の凍結物でC-液体中に凍結した。 以下の手順はすべて、特に明記されていない限り、バイオセーフティキャビネットで行われます。
1. 基質膜マトリックス希釈およびプレートコーティング
<ol><li>希薄(1:50)成長因子は、フェノールレッドなしのダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)のエンゲルブレス-ホルム群発腫瘍から精製された基質膜マトリックスを減少させた。</li>
	<li>細胞培養プレートに適量の希釈基質膜マトリックス(すなわち、6ウェルプレート=1mL、12ウェルプレート=0.5mL)を塗布し、これらのプレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベートする。</li>
</ol>2. iPSC メンテナンス
注:6ウェルフラットボトムプレートのウェルあたりの最大合流値は〜1.2 x 106 細胞です。
<ol><li>凍結保存されたiPSCを10 μM Y-27632でSCMに解凍し、希釈成長因子でコーティングされた6ウェルプレートにプレートを貼り付け、基部膜マトリックスを減少させます。</li>
	<li>解凍後の最初の24時間、10 μM Y-27632でIPSCをSCMに維持します。24時間後に新鮮な培地に切り替えます。</li>
	<li>細胞が合格する前に80-90%の合流度に達するまで、SCMでiPSCを維持します。<ol>
<li>分化に必要な密度(15,600セル/cm2)をウェルの表面積で乗算することにより、分化に必要なiPSCの数を計算します。6ウェルフラットボトムプレートの場合、15,600個のセル/cm2 に9.6cm2 を掛け、合計149,760個の細胞/ウェルを求めます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通過するには、ハンクスのバランス塩溶液(HBBS)で細胞を洗います。次いで、37°Cで5分間非酵素性エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)(材料リストを参照)で細胞をインキュベートする。<ol>
<li>セルスクレーパーを使用して、細胞をそっと持ち上げます。新鮮なSCMで細胞を収集します。</li>
		<li>細胞を希釈したSCMでコーティングし、ステップ2.3に記載されているように細胞を維持するか、SCMの1mL、10μM Y-27632、および10%DMSO(v/v)を-160°Cの温度で液体窒素中の凍結保存バイアルに保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. BMEC に対する iPSC の差別化
注: 非酵素 EDTA は細胞を束に分離します。酵素EDTA( 材料表を参照)は、細胞を単一細胞懸濁液に分離する。レチノイン酸(RA)は光から保護する必要があります。
<ol><li>ダルベッコのリン酸緩衝液生理食塩基(DPBS)でiPSCを一度洗います。酵素EDTA(6ウェルプレート用1mL、12ウェルプレートの場合は0.5mL、24ウェルプレートでは0.25mL)を37°Cで約5分間インキュベートし、単一の細胞懸濁液を得る。</li>
	<li>細胞と遠心分離機を室温で5分間300xg(相対遠心力)で収集します。10 μM Y-27632 を含む SCM の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>トリパンブルーと自動セルカウンターまたはヘモサイトメーター装置を使用して細胞密度を決定します。SCMの15,600細胞/cm2 または149,760細胞/ウェルの密度のプレートセルは、10 μM Y-27632を24時間含むSCMの6ウェルフラットボトムプレート(表面積9.6 cm2/well)です。</li>
	<li>SCMをE6培地に変更して24時間後に分化を開始します。次の4日間、E6培地を毎日変更します。</li>
	<li>分化の4日目に、希釈(1:200)B27サプリメント、20 ng / mL bFGF、および10 μM RAを添加したhESFMでE6培地を交換してください。このメディアは、次の 48 時間変更しないでください。</li>
	<li>希釈(1:200)B27でhESFMの200 mLを調製し、hESFMの199 mLに50倍濃縮B27サプリメントの1 mLを混合します。</li>
	<li>トリスバッファー(5 mMトリス、pH 7.6、150 mM NaCl)の250 μLで50 μgのbFGFを再構成して、200 μg/mL のストック溶液を作り出し、bFGF の 20 ng/mL を調製します。200 μg/mL bFGF の 20 μL を 200 mL の hESFM と混合して 200 ng/mL bFGF を含む hESFM の 200 mL を準備します。</li>
	<li>まず、2.5 mLのDMSOを100mgのRA粉末に加えて、40mg/mLのRAストック溶液を作って10μM RAを調製します。この濃度を3 mg/mLに希釈して10 mMのストック液を作ります。10μM RAを含むhESFM 200 mLを200 mL hESFMに200 μM RAの200 μL混合して準備します。</li>
</ol>4. iPSC由来BMECの精製用コラーゲンIV(COL4)およびフィブロネクチン(FN)マトリックスのコーティング
<ol><li>2 mg/mL FNストック溶液を作るためにFNの2mgに滅菌水の2 mLを加えます。5 mg/mL COL4 ストック溶液を作るために5 mg の COL4 に無菌水の 5 mL を加えます。<ol>
<li>FNを37°Cで少なくとも30分間溶解させ、コル4を室温で溶解させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌水中のFNストック溶液を100 μg/mLの最終濃度に希釈し、コル4ストック溶液を400 μg/mLの最終濃度にします。</li>
	<li>目的のプレート(6ウェルプレート=1mLのCOL4/FN溶液、12ウェルプレート=0.5mL、24ウェルプレート=0.25mL、12トランスウェル濾過プレート=0.25mL)を400μg/mL COL4と100μg/FNLの混合物でコーティングします。</li>
	<li>プレートを37°Cで最低2時間または一晩インキュベートします。トランスウェルの濾過プレートには、最低4時間を推奨します。</li>
</ol>5. iPSC由来BMECsのサブカルチャーと精製
注:酵素EDTAによるインキュベーションは、分化の6日目の細胞の合流度に応じて15分以上かかることがあります。
<ol><li>分化の6日目に、DPBSで細胞を2回洗浄する。1 mLの酵素EDTAを1mLで、1つの細胞懸濁液が得られるまで37°Cで少なくとも15分間インキュベートする。</li>
	<li>室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。希釈された(1:200)B27サプリメント、20 ng / mL bFGF、および10 μM RAで新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>400 μg/mL COL4 と 100 μg/mL FN の混合物でコーティングされたプレートに細胞をシード. 12 ウェルプレートの 3 ウェルに対する 6 ウェルの比率を使用して、12-トランスウェルフィルタープレートの 3 つのウェル、または 24 ウェル プレートの 6 ウェル。</li>
	<li>同じ細胞株から、TEER分析用の負のコントロールとして、12トランスウェル濾過プレートをコーティングした12トランスウェルにコーティングされたプレートに未分化のiPSCをシードします。</li>
	<li>サブ培養の24時間後、B27サプリメントのみで培地をhESFMに変更する。この手順の後に、メディアの変更は必要ありません。</li>
</ol>6. 発芽アッセイ
<ol><li>8日目のiPSC由来BMECを収集し、100,000個の細胞/ウェルで播種し、200μL/cm2 の基底膜マトリックスでコーティングされた24ウェルフラットボトムプレートに播種します。</li>
	<li>これらの細胞を希釈(1:200)B27および40ng/mLの血管内皮増殖因子A(VEGFA165)で治療してください。</li>
	<li>細胞を24時間ごとに観察し、2日ごとに培地を変える。</li>
</ol>7. 免疫細胞化学(ICC)
メモ:ICCは24ウェルフラットボトムプレート上で行われます。
<ol><li>48時間のサブ培養(8日目)の後、DPBSで細胞を2回洗浄する。4%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を20分間固定します。</li>
	<li>DPBSで細胞を3回洗浄し、1回5分洗浄します。5%ロバ血清と0.3%トリトンX-100(v/v)を用いたDPBSの室温で1時間のプレブロック細胞。</li>
	<li>一次抗体でインキュベート:マウス抗ヒトPECAM1(1:100、ストック0.5mg/mL)、ウサギの抗ヒトTJP1(1:200、 在庫 0.53 mg/mL、マウス抗ヒトCLDN5(1:200、在庫0.5 mg/mL)、マウス抗ヒトOCLN(1:200、ストック0.5 mg/mL)、ウサギの抗ヒトSLC2A1(1:100、在庫0.2 mg/mL)、DPBSで一晩で5%のドンキーを含む<ol>
<li>DPBSで細胞を一度洗い流し、次にDPBSで1回5分間洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>二次抗体を含むインキュベート細胞:ロバ抗ウサギアレクサFluor 555(1:200)とロバ抗マウス488(1:200)を含むDPBSで5%ロバ血清を1時間含む。</li>
	<li>このインキュベーションに続いて、Hoechst 33342三水塩化物三水和物をDPBSで10分間希釈(1:1000)を加えます。<ol>
<li>Hoechst 33342溶液を取り出し、DPBSで1回洗い流し、1回の洗浄につき5分間DPBSで4回洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、細胞メーカーの発現と局在を探します。</li>
</ol>8. TEERの測定および分析
注:コーニング12-トランスウェル濾過プレートは、1.12 cm2 ポリエチレンテレフタレート膜および0.4マイクロメートルの細孔からなるフィルタが装備されています。TEERの測定は技術的(ウェルあたり3)および生物学的複製(細胞株および/または条件当たり3つのウェル)で得られる。
<ol><li>サブ培養(7日目)の24時間後に、24時間ごとに箸電極とボルトメーターを使用してTEERを測定します。測定の取得に関する具体的な説明については、voltohmmmeterユーザーマニュアルを参照してください。<ol>
<li>TEERを測定するには、前の晩に電圧計計を充電します。楽器と箸の電極を70%エタノールで軽く拭き取ってから、安全フードに入れます。</li>
		<li>電源を入れ、製造元が推奨するオームメーターを調整します。</li>
		<li>70%エタノールを使用して箸の電極とリンス電極を差し込み、その後DPBSを使用します。</li>
		<li>短い端電極をトランスウェルインサート(アピカルチャンバー)に入れ、長い端をバソラハアチャンバーに入れます。</li>
		<li>まず、COL4/FNのみでコーティングされたブランクウェルを測定します。その後、他の井戸を測定します。</li>
		<li>異なる条件(すなわち異なる細胞株を測定する)を測定するとき、70%エタノールとDPBSで箸の電極を素早くすすぐ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての測定(Ω)が記録された後、70%エタノールと滅菌水で箸の電極をすすいでください。電極を軽く拭き取り、安全フード内で空気を乾燥させます。</li>
	<li>空白ウェルから TEER 値 (Ω) を 3 重に平均し、条件ごとに各未加工の TEER 値からこの平均値を差し引きます。<ol>
<li>減算された値を平均化し、1.12 cm2 (12 トランスウェル挿入物の表面積) を掛けます。</li>
		<li>ステップ 6 の変換された値を使用して、TEER 測定の各日の TEER 値と標準誤差を示すグラフを生成します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 流出トランスポーターの活動と分析
注:流出トランスポーター活性アッセイは、24ウェルフラットボトムプレート上で行われます。目的の流出トランスポーターは、ABCB1およびABCC1を含む。各条件は、コントロールウェル(すなわち、それぞれの阻害剤のないブランクウェル)で三重に行われることをお勧めします。
<ol><li>48時間のサブ培養(8日目)の後、10μMバルスポダール(ABCB1阻害剤)または10μM MK571(ABCC1阻害剤)を37°Cで1時間インキュベートする。<ol>
<li>412 μLのDMSOに5mgの粉末(1214.64 g/mol)を溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mMバルスポダールストックを調製します。例えば、10 μM バルスポダールで 10 mL の hESFM を作るためには、10 mM バルスポダールの 10 μL を 10 mL の hESFM と混ぜます。</li>
		<li>5 mg粉末(537.07 g/mol)を931 μLに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mM MK571ストックを調製します。例えば、10 μM MK571で10 mLのhESFMを作るためには、10 mM MK571ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1時間後、10μMローダミン123(ABCB1基質)または10μM2',7'-ジクロロジヒドロフルオレシンジアセインジアセインジアセア(H2DCFDA、ABCC1基質)を37°Cで1時間、または無用にインキュベートする細胞。<ol>
<li>10 mgの粉末(380.82 g/mol)をDMSOの875 μLに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して10 mMローダミン123を調製します。例えば、10 μMローダミン123で10mLのhESFMを作るために、10 mMローダミン123ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混合します。</li>
		<li>50 mgの粉末(487.29 g/mol)を10.26 mLのDMSOに溶解し、10 μMの作動濃度に希釈して、10 mM H2DCFDAを調製します。例えば、10 μMローダミン123で10mLのhESFMを作るために、10 mMローダミン123ストックの10 μLを10 mLのhESFMと混合します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>5%トリトンX(v/v)を含むDPBSを使用して、0.5 mLのDPBSと溶菌で細胞を2回洗浄します。</li>
	<li>マルチプレートまたはマイクロプレートリーダーを使用して、細胞の発光を測定します(材料リストを参照)。<ol>
<li>蛍光プレートリーダーの計測器を485ナノメートル励起と530ナノメートルの発光に設定し、これらの波長で蛍光を測定します。</li>
		<li>トランスポーターアッセイに使用されていないウェルの場合、細胞核定量のために4%PFAで固定する前に、DPBSで細胞を2回洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hoechst 33342三水和物を用いたインキュベート細胞は、DPBSで10分間希釈した三水塩化物(1:1000)各ウェルに複数の視野を画像化し、蛍光顕微鏡を用いて平均細胞核数を計算する。</li>
	<li>フィジーを使用して核を数え、これらのカウントに細胞ごとに蛍光値を正規化します。<ol>
<li>それぞれのブランク値から各条件の生蛍光蓄積値を差し引いて、蛍光の平均蓄積を計算する。</li>
		<li>各条件の平均減算値。</li>
		<li>ステップ 9.6.1 の平均値を平均セル数で割ります。これらの値を使用して、細胞ごとに蛍光値を正規化します。</li>
		<li>正規化された値を使用して、各インヒビター条件のグラフィカル表現を生成し、必要な統計分析を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. BMECのパッシング、拡大、凍結保存
<ol><li>希釈された(1:200)B27を補充した新鮮なhESFMで8日目のBMEC培養物を補充し、細胞がCOL4 / FNマトリックスでさらに2日間拡大できるようにします。</li>
	<li>新しい12-トランスウェルろ過プレートと24ウェルフラットボトムプレートに400 μg/mL COL4と100 μg/mL FNをコーティングし、4時間インキュベートします。</li>
	<li>10日目に、DPBSで細胞を洗浄し、1つの細胞懸濁液が得られるまで37°Cで少なくとも15分間酵素EDTAの1mLでインキュベートする。</li>
	<li>室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。<ol>
<li>これらの細胞を凍結保存するには、30%の胎児ウシ血清(FBS)および10%DMSOで新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁する。</li>
		<li>iPSC由来のBMECを-80°Cで最初の24時間イソプロパノール容器に凍結保存されたバイアルに保存し、次に液体窒素に入れて-160°Cで長期保存します。</li>
		<li>これらの細胞を通過させるために、希釈された(1:200)B27を補充した新鮮なhESFMで細胞ペレットを再懸濁する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ10.2で調製したコーティングされたプレートに細胞をシードする。6ウェルプレートの1ウェルの比を使用して、12-トランスウェル濾過プレートの3つの井戸と24ウェルプレートの6ウェルにシードセル。細胞が 24 時間成長し、拡大することを許可します。</li>
	<li>11日目に、ステップ8に記載されているステップに従ってTEERを測定します。</li>
	<li>12日目に、手順9に記載されている手順に従ってICCを実行します。</li>
	<li>凍結保存されたBMECを解凍するには、凍結保存されたバイアルを温水またはビーズバスの37oCに入れます。解凍したBMECsを希釈(1:200)B27で補ったhESFMの5 mLに移します。<ol>
<li>室温で5分間300×gで遠心分離を介して細胞を収集する。希釈(1:200)B27、10 μM RA、10 μM Y-27632を補ったhESFMで細胞を再懸濁します。</li>
		<li>24時間後、希釈された(1:200)B27と10 μM Y-27632を添加したhESFMに媒体をRAなしで切り替える。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

変更とトラブルシューティング
このプロトコルでは、BMECsの誘導のためにiPSC培養中に一般的に使用される細胞外マトリックスおよび細胞培養培地を使用する際にいくつかの変更を加えた(図1)。これらの変更は、Lippmann プロトコル1に記載されているように、ヒト iPSC から BMECS を導出する能力に影響を与えませんでした?...

血液脳関門機能 血液脳関門(BBB)は、血液から脳への物質の移動を制限する境界を形成する。BBBは、血管系を裏打ちする単層を形成する脳内血管内皮細胞(BMEC)で構成される。BMECは、アストロサイト、ニューロン、ペリサイト、ミクログリア、および細胞外マトリックスと共に、神経血管ユニットを形成する。BMECは、BBBが高い経皮電気抵抗(TEER)を維持することを可能にする厳しく調節されたパラセルラー構造を有し、受動拡散を制限し、バリア完全性1、2の指標として機能する。BMECsはまた、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス、およびトランスマイグレーションなどの細胞間移動を助けるタンパク質、ならびに免疫応答3中の白血球の飛散を助けるタンパク質を有する。BMECは、脳内の恒育的バランスを維持するために、廃棄物の栄養と除去のために流入および流出輸送器に依存しています3.例えば、溶質キャリアファミリー2メンバー1(SLC2A1)は、BBB4を横切るグルコースの移動を担う流入トランスポーターであり、ATP結合カセットサブファミリーBメンバー1(ABCB1)およびATP結合カセットサブファミリーCメンバー1(ABCC1)などの流出トランスポーターは、基材を血流3、5、6、7に戻す責任を負う。ABCB1基質は、モルヒネ、ベラパミル4、オランザピンおよびリスペリドン8などの抗精神病薬を含み、一方、ABCC1トランスポーターは、硫酸コンジュゲート、ビンクリスチン、グルクロニド共役体4を含む様々な基質を有する。
精神障害におけるBBBモデルの応用 BBB機能障害は、統合失調症および双極性障害9,10を含む多くの神経学的および精神疾患に関与している。近年、iPSC由来のex vivo細胞モデルは、精神疾患の細胞および分子基盤を問い合わせるのに利用されているが、これらのモデルは現在、神経血管系11、12、13が果たす潜在的な役割を考慮していない。血液中を循環する末梢炎症性サイトカインがBBB14、15、16、17に悪影響を及ぼす可能性があると仮定されているが、細胞内18、19、20、21、22、トランスセルラー23、24、25、26、27、28、29、および細胞外マトリックス20、29、302、32に対する異常を示す証拠もある。 BBBの破壊は、血液の内容物が脳実質に入り、アストロサイトおよび/またはミクログリアを活性化して炎症性サイトカインを放出し、脳34に有害な影響を及ぼし得る炎症反応33を開始する。BMECはBBBの主要な構成要素であり、これらの細胞の構造および機能を調べることは、神経学的および精神障害におけるBBB機能不全の理解を高めることができる。
代替BMECモデル iPSC1,6,35,36からBMECを導出するための効率的なプロトコルが開発される前に、研究者はBBB機能を研究するために不死化BMEC37を採用していました。しかしながら、これらのモデルの多くは望ましいBBB型を達成することができず、このようなTEER値の生理学的範囲は38,39である。iPSCを利用することは、細胞が由来する個体の遺伝的背景を保持するという利点がある。科学者たちは、人間の脳の構造と機能を再現するiPSC由来のex vivo微小環境モデルの確立に積極的に取り組んでいます。研究者たちは、生体内で見つかったBMECsと構造的および生理的に類似したBMECを導き出す方法を開発した。iPSC由来BMECの精製集団を得るための方法は、プロトコルが過去数年間に最適化されているいくつかの異なるステップを必要とします1,6,35,36.一般に、iPSC由来BMECは、エッセンシャル6(E6)培地で4日間培養され、続いてヒト内皮無血清培地(hESFM)に塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、レチノイン酸(RA)、およびB27サプリメントを添加して2日間培養する。次に、細胞をコラーゲンIV(COL4)およびフィブロネクチン(FN)マトリックスで培養し、90%均質BMECs1を得る。
BMECの同一性は、血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM1)、SLC2A1、およびタイト接合タンパク質1(TJP1)、閉塞子タンパク質(OCLN)、およびクローディン-5(CLDN)6などの緊密な接合タンパク質を含むBMECタンパク質の共発現を示す免疫蛍光によって確認される。発芽アッセイは、iPSC由来BMECの血管新生電位を確認するために使用されてきた。6 BMECのBBB完全性は、ヒロインテエル値(〜2000Ω xcm2)37の存在とABCB1およびABCC11、6、36などの流出トランスポーターに対する測定可能な活性によって評価される。Lippmannグループによる最近の方法論的進歩は、実験変動性の低下と再現性の強化を伴うiPSC由来のBMECプロトコルに至った。しかし、彼らがサブ培養段階を超えて拡大し、通過できるかどうかは不明である。私たちの変更されたプロトコルは、8日目以降にiPSC由来のBMECを渡し、凍結保存後にBBBプロパティをさらに拡張できるかどうかを評価することによって、この問題に対処することを目指しています。iPSC由来BMECの経食について記述した研究はないが、凍結融解サイクル40を受けた後に生理学的BBB特性を保持するBMEC凍結保存のためのプロトコルが存在する。しかし、凍結保存後BMECを通過させ、BBB特性を保持できることは知られていない。
Lippmann プロトコルを使用して iPSC から派生した BMEC は、ハンチントン病などの神経疾患における BBB 破壊をモデル化するために利用されてきた7.このようなiPSC由来BMECは、それぞれ41,42の血液CSFバリア及びBBBの破壊に対するナイセリア髄膜炎又はB群連鎖球菌などの細菌感染の影響を調べるためにも用いられている。また、統合失調症患者の22q欠失症候群患者からのiPSC由来BMECを用いて、研究者は、脳43への白血球の募集および外挿を補助するBMECの主要な接着分子である細胞間接着分子-1(ICAM-1)の増加を観察した。これらの研究をまとめると、複雑な神経精神疾患におけるBBB破壊を研究するためのiPSC由来BMECの有用性を示す。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

脳内血管内皮細胞(BMEC)は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から分化し、血液脳関門(BBB)機能を研究するためのex vivo細胞モデルを開発することができます。この変更されたプロトコルは、以前のプロトコルで報告されたものとは異なるドナーと試薬を使用して、ヒトのiPSCからBMECを導き出し、拡張し、凍結保存するための詳細な手順を提供します。iPSCは必須6培地で4日間処理され、続いて2日間のヒト内皮無血清培地に塩基性線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸、およびB27サプリメントを添加した。6日目に、細胞をコラーゲン/フィブロネクチンマトリックス上で2日間分培養する。免疫細胞化学は、CLDN5、OCLN、TJP1、PECAM1、およびSLC2A1を用いたBMECマーカー分析のために8日目に行われる。ウェスタンブロッティングは、BMECマーカー発現を確認するために行われ、および、内皮マーカーであるSOX17の不存在を確認する。血管形成の可能性は、発芽アッセイで実証される。7日目から箸電極と電圧計を用いて、電気抵抗(TEER)を使用して、内皮間を越えた電気抵抗(TEER)を測定します。ATP結合カセットサブファミリーB部ファミリーB部材1及びATP結合カセットサブファミリーC部材1に対する流出トランスポーター活性は、8日目にマルチプレートリーダーを用いて測定される。BMECsの誘導に成功した、関連する細胞マーカーの存在によって確認され、SOX17の低レベル、血管新生電位、トランスポーター活性、およびTEER値〜2000 Ω xcm2。BMECは、コーティングされたばかりのコラーゲン/フィブロネクチンプレートまたは凍結保存に加える前に、10日目まで拡張されます。このプロトコルは、iPSC由来のBMECを少なくとも1回拡張して通行できることを示しています。しかしながら、凍結保存後に、低いTEER値およびBMECマーカーの局在化不良が観察された。BMECは、他の細胞タイプ(ニューロン、グリア、ペリサイト)、3次元脳モデル(オルガンチップおよびヒドロゲル)、脳オルガノイドの血管化、および神経精神疾患におけるBBB機能障害の研究に使用できます。

BMEC差別化 このプロトコルのいくつかの重要な手順は正確に実行する必要があります (図 1) 。1日目のE6培地使用は重要であり、比較的短時間でiPSCから神経外発性系統を導出するために用いられることが多いため、複数の細胞株36にわたって再現可能な結果を生み出す。もう一つの重要なステップは、E6培地が希釈された(1:200)B27、20 ng / mL b...

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Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞を分化して得られる脳内血管内皮細胞を導き出し、拡大、および凍結保存し、 また、ex vivo モデルにおける血液脳関門特性を研究するための適応法を詳述する。

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

derivation-expansion-cryopreservation-characterization-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.2K ビュー.  Massachusetts General Hospital. 本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞を分化して得られる脳内血管内皮細胞を導き出し、拡大、および凍結保存し、 また、ex vivo モデルにおける血液脳関門特性を研究するための適応法を詳述する。

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Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

神経科学

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

初代マウス脳微小血管内皮細胞の単離

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

多能性幹細胞からのヒト神経細胞および希突起膠細胞の作製によるニューロン-希突起膠細胞相互作用のモデル化

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...