Diese Arbeit wurde durch den National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (to R.K.), a National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL) unterstützt. ein National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (nach R.K.), ein Sydney R Baer Jr Foundation Grant (zu P.L.), der Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (nach R.K.), die Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (zu R.K.), die Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (zu R.K.), das Harvard Stem Cell Institute (zu R.K.) und von Steve Willis und Elissa Freud (zu R.K.). Wir danken Dr. Annie Kathuria für ihre kritische Lektüre und ihr Feedback zum Manuskript.

Human ePSCs wurden von den Fibroblasten gesunder Spender mit einem von den Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital und McLean Hospital genehmigten Protokoll umprogrammiert und wie in früheren Studienbeschrieben 44,45,46charakterisiert.
HINWEIS: Kurz gesagt, Fibroblasten wurden über mRNA-basierte genetische Neuprogrammierung47auf iPSC umprogrammiert. Die iPSCs wurden im Stammzellmedium (SCM) (siehe Materialliste) gehalten und mit einer Dichte von 1,2 x 102 Zellen/ml mit 1 ml SCM, 10 m mit rho-assoziiertem Proteinkinase-Inhibitor (ROCKi) Y-27632 und 10% (v/v) Dimethylsulfid (DMSO) in kryopreserveden Durchstechflaschen in flüssigem Stickstoff bei -160 °C gelagert. Alle nachstehenden Verfahren werden in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
1. Kellermembranmatrixverdünnung und Plattenbeschichtung
<ol><li>Verdünnter (1:50) Wachstumsfaktor reduzierte Kellermembranmatrix, die vom Engelbreth-Holm-Schwarmtumor in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Phenolrot gereinigt wurde.</li>
	<li>Beschichten Sie Zellkulturplatten mit der entsprechenden Menge an verdünnter Kellermembranmatrix (d.h. 6-Well-Platte = 1ml, 12-Well-Platte = 0,5 ml) und bebrüten diese Platten mindestens 1 Stunde bei 37 °C.</li>
</ol>2. iPSC Wartung
HINWEIS: Die maximale Konfluenz pro Brunnen in einer 6-Well-Flachbodenplatte beträgt 1,2 x 106 Zellen.
<ol><li>Thaw kryokonreserved iPSCs in SCM mit 10 'M Y-27632 und Platte auf eine 6-Well-Platte mit verdünntem Wachstumsfaktor reduziert Kellermembran Matrix beschichtet.</li>
	<li>Halten Sie iPSCs in SCM mit 10 M Y-27632 für die ersten 24 Stunden nach dem Auftauen aufrecht. Wechseln Sie nach 24 Stunden auf frisches Medium.</li>
	<li>Bewahren Sie iPSCs in SCM auf, bis die Zellen vor dem Passieren 80-90% Koninfluenza erreichen.<ol>
<li>Berechnen Sie, wie viele iPSCs für die Differenzierung benötigt werden, indem Sie die gewünschte Dichte zur Differenzierung (15.600 Zellen/cm2) mit der Oberfläche des Brunnens multiplizieren. Für eine 6-Well-Flachbodenplatte 15.600 Zellen/cm2 x 9,6 cm2 für insgesamt 149.760 Zellen/Well multiplizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um durchzufahren, waschen Sie die Zellen mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS). Dann inkubieren Sie die Zellen mit nicht-enzymatischer Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (siehe Materialliste) für 5 Minuten bei 37 °C.<ol>
<li>Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen sanft zu entfernen. Sammeln Sie Zellen in frischem SCM.</li>
		<li>Plattenzellen auf Zellkulturplatten, die mit verdünntem SCM beschichtet sind, und halten Zellen, wie in Schritt 2.3 beschrieben, oder lagern sie bei 1,2 x 106 Zellen/ml in 1 ml SCM, 10 M Y-27632 und 10 % DMSO (v/v) in kryopservierten Durchstechflaschen in flüssigem Stickstoff bei einer Temperatur von -160 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Differenzierung von iPSCs zu BMECs
HINWEIS: Nicht-enzymatische EDTA trennt Zellen in Klumpen. Enzymatische EDTA (siehe Materialtabelle) trennt Zellen in einzellige Suspension. Retinsäure (RA) sollte vor Licht geschützt werden.
<ol><li>Waschen Sie iPSCs einmal mit Dulbeccophosphat Buffer Saline (DPBS). Mit enzymatischer EDTA (1 ml für 6-Well-Platte, 0,5 ml für 12-Well-Platte und 0,25 ml für 24-Well-Platte) ca. 5 Minuten bei 37 °C inkubieren, um eine Einzelzellsuspension zu ergeben.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellen und Zentrifuge bei 300 x g (relative Zentrifugalkraft) für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspend Zellpellets in SCM mit 10 M Y-27632.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Zelldichte mit Trypan Blue und einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämozytometer. Plattenzellen mit einer Dichte von 15.600 Zellen/cm2 oder 149.760 Zellen/Well einer 6-Well-Flachbodenplatte (mit einer Oberfläche von 9,6 cm2/well) in SCM mit 10 'M Y-27632 für 24 Stunden.</li>
	<li>Initiieren Sie die Differenzierung nach 24 Stunden, indem Sie SCM in E6-Medium ändern. Ändern Sie E6 medium täglich für die nächsten 4 Tage.</li>
	<li>Ersetzen Sie am 4. Tag der Differenzierung E6 medium durch hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27 Ergänzung, 20 ng/mL bFGF und 10 M RA. Ändern Sie dieses Medium nicht für die nächsten 48 Stunden.</li>
	<li>200 ml hESFM mit verdünntem (1:200) B27 vorbereiten, 1 ml 50x konzentrierte B27-Ergänzung zu 199 ml hESFM mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie 20 ng/ml bFGF vor, indem Sie 50 g bFGF in 250 l Tris-Puffer (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) rekonstituieren, um eine 200-g/ml-Stammlösung herzustellen. Bereiten Sie 200 ml hESFM mit 20 ng/mL bFGF vor, indem Sie 20 l von 200 g/ml bFGF mit 200 ml hESFM mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie 10 M RA vor, indem Sie zuerst eine 40 mg/ml RA-Lagerlösung herstellen, indem Sie 2,5 ml DMSO auf 100 mg RA-Pulver hinzufügen. Verdünnen Sie diese Konzentration auf 3 mg/ml, um eine 10 mM Stofflösung herzustellen. Bereiten Sie 200 ml hESFM mit einer Menge von 10 M RA vor, indem Sie 200 l von 10 m RA in 200 ml hESFM mischen.</li>
</ol>4. Beschichtung Kollagen IV (COL4) und Fibronectin (FN) Matrix zur Reinigung von iPSC-Derived BMEC
<ol><li>Fügen Sie 2 ml steriles Wasser auf 2 mg FN hinzu, um 1 mg/ml FN-Stammlösung herzustellen. Fügen Sie 5 ml steriles Wasser auf 5 mg COL4 hinzu, um eine 1 mg/ml COL4-Stammlösung herzustellen.<ol>
<li>LASSEN Sie FN für mindestens 30 Minuten bei 37 °C auflösen und der COL4 bei Raumtemperatur auflösen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die FN-Stammlösung in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 g/ml und COL4-Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 400 g/ml verdünnt.</li>
	<li>Beschichten Sie die gewünschten Platten (6-Well-Platte = 1 ml COL4/FN-Lösung, 12-Well-Platte = 0,5 ml, 24-Well-Platte = 0,25 ml und 12-Transwell-gefilterte Platte = 0,25 ml) mit der Mischung aus 400 g/ml COL4 und 100 g/ml FN.</li>
	<li>Platten mindestens 2 Stunden oder über Nacht bei 37 °C inkubieren; für Transwell gefilterte Platten wird mindestens 4 Stunden empfohlen.</li>
</ol>5. Unterkultur und Reinigung von iPSC-abgeleiteten BMECs
HINWEIS: Die Inkubation mit enzymatischer EDTA kann je nach Konfluenz der Zellen am 6. Tag der Differenzierung länger als 15 Minuten dauern.
<ol><li>Am 6. Tag der Differenzierung, waschen Zellen zweimal mit DPBS. Mit 1 ml enzymatischer EDTA mindestens 15 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis eine einzellige Suspension erhalten ist.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspend Zellpellets mit frischem hESFM mit verdünnten (1:200) B27 Ergänzung, 20 ng/mL bFGF, und 10 M RA.</li>
	<li>Samenzellen auf Platten, die mit einer Mischung aus 400 g/mL COL4 und 100 g/ml FN beschichtet sind. Samenzellen mit einem Verhältnis von 1 Brunnen einer 6-Well-Platte zu 3 Brunnen einer 12-Well-Platte, 3 Brunnen einer 12-Transwell-gefilterten Platte oder 6 Brunnen einer 24-Well-Platte.</li>
	<li>Saat undifferenzierte iPSCs aus der gleichen Zelllinie auf COL4/FN beschichtet12-Transwell gefilterte Platte als Negativkontrolle für die TEER-Analyse.</li>
	<li>Nach 24 Stunden Sub-Kultivierung, ändern Medium zu hESFM mit B27 Ergänzung nur. Nach diesem Schritt sind keine mittleren Änderungen erforderlich.</li>
</ol>6. Sprouting Assay
<ol><li>Sammeln Sie Day 8 iPSC-abgeleitete BMECs und säen Sie sie mit 100.000 Zellen/Well auf eine 24-Well-Flachbodenplatte, frisch beschichtet mit 200 l/cm2 Kellermembranmatrix.</li>
	<li>Behandeln Sie diese Zellen mit hESFM mit verdünntem (1:200) B27 und 40 ng/ml vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor A (VEGFA165).</li>
	<li>Beobachten Sie Zellen alle 24 Stunden und ändern Sie das Medium alle zwei Tage.</li>
</ol>7. Immunzytochemie (ICC)
HINWEIS: ICC wird auf 24-Well-Flachbodenplatten durchgeführt.
<ol><li>Nach 48 Stunden Subkultivierung (Tag 8) zweimal Zellen mit DPBS waschen. Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 Minuten.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen dreimal mit DPBS, 5 Minuten pro Wäsche. Vorblockzellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur in DPBS mit 5% Eselserum und 0,3% Triton X-100 (v/v).</li>
	<li>Inkubat mit primären Antikörpern: Maus Anti-Human-PECAM1 (1:100, Lager 0,5 mg/ml), Kaninchen anti-human-TJP1 (1:200, Lager 0,53 mg/ml), Maus anti-human-CLDN5 (1:200, Lager 0,5 mg/ml), Maus-Anti-Human-OCLN (1:200, Lager 0,5 mg/ml) und Kaninchen Anti-Human-SLC2A1 (1:100, Lager 0,2 mg/ml) in DPBS mit 5% Eselserum über Nacht bei 4°C.<ol>
<li>Spülen Sie die Zellen einmal mit DPBS und waschen Sie dann fünfmal für 5 Minuten pro Wäsche mit DPBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen mit sekundären Antikörpern: Esel-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 (1:200) und Esel-Anti-Maus 488 (1:200) in DPBS mit 5% Eselserum für 1 Stunde.</li>
	<li>Nach dieser Inkubation fügen Sie Hoechst 33342 Trihydrochlorid-Trihydrat verdünnt (1:1000) in DPBS für 10 Minuten hinzu.<ol>
<li>Entfernen Sie die Hoechst 33342 Lösung und spülen Sie sie einmal mit DPBS und waschen Sie sie viermal mit DPBS für 5 Minuten pro Wäsche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualisieren Sie Zellen auf Fluoreszenzmikroskopen, um nach Expression und Lokalisierung von Zellerstoren zu suchen.</li>
</ol>8. TEER Messung und Analyse
HINWEIS: Corning 12-Transwell gefilterte Platten sind mit Filtern ausgestattet, die aus 1,12 cm2 Polyethylenterephthalatmembranen und 0,4 Mikrometer Poren bestehen. TEER-Messungen werden in technischen (3 pro Brunnen) und biologischen Replikationen (3 Brunnen pro Zelllinie und/oder Zustand) durchgeführt.
<ol><li>Messen Sie TEER 24 Stunden nach der Subkultivierung (Tag 7) mit Essstäbchenelektroden und einem Voltohmmeter alle 24 Stunden. Spezifische Anweisungen zur Messung finden Sie im Voltohmmeter-Benutzerhandbuch.<ol>
<li>Um TEER zu messen, laden Sie das Voltohmmeter-Instrument am Vorabend auf. Wischen Sie das Instrument und die Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol leicht ab, bevor Sie sie in die Sicherheitshaube legen.</li>
		<li>Schalten Sie das Ohm-Messgerät ein und kalibrieren Sie es, wie vom Hersteller empfohlen.</li>
		<li>Stecken Sie die Essstäbchenelektroden ein und spülen Sie Elektroden mit 70% Ethanol gefolgt von DPBS.</li>
		<li>Legen Sie die kürzere Endelektrode in den Transbrunneneinsatz (die apikale Kammer) und das längere Ende in die basolaterale Kammer.</li>
		<li>Messen Sie zunächst einen Rohbrunnen, der nur mit COL4/FN beschichtet ist. Dann messen Sie die anderen Brunnen.</li>
		<li>Schnelles Spülen von Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol, gefolgt von DPBS bei der Messung verschiedener Bedingungen (d. h. Messung verschiedener Zelllinien).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem alle Messungen (in Ω) aufgezeichnet wurden, spülen Sie Essstäbchenelektroden mit 70% Ethanol und dann sterilem Wasser aus. Elektrode vorsichtig abwischen und in der Sicherheitshaube die Luft trocknen lassen.</li>
	<li>Durchschnittliche Ausführung der teER-Werte (in Ω) aus dem leeren Brunnen, und subtrahieren Sie diesen Durchschnittswert von jedem Rohwert des TEER nach Bedingung.<ol>
<li>Durchschnittlich die subtrahierten Werte und multiplizieren Sie sie mit 1,12 cm2 (die Oberfläche des 12-Transwell-Einsatzes).</li>
		<li>Verwenden Sie transformierte Werte aus Schritt 6, um das Diagramm mit TEER-Wert und Standardfehlern für jeden Tag der TEER-Messung zu generieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Efflux Transporter Aktivität und Analyse
HINWEIS: Efflux Transporter Aktivität Assay wird auf einer 24-well-Flachbodenplatte durchgeführt. Zu den Voninteresse entoselnden Efflux-Transportern gehören ABCB1 und ABCC1. Es wird empfohlen, dass jede Bedingung in Dreifacharbeit mit Kontrollbrunnen (d. h. leerer Brunnen ohne die jeweiligen Inhibitoren) durchgeführt wird.
<ol><li>Nach 48 Stunden Subkultivierung (Tag 8) brüten Zellen mit 10 M Valspodar (ABCB1-Hemmer) oder 10 M MK571 (ABCC1-Hemmer) 1 Stunde bei 37 °C.<ol>
<li>Bereiten Sie 10 mM Valspodar-Bestand vor, indem Sie 5 mg Pulver (1214,64 g/mol) in 412 l DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 m Valspodar herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 ml Valspodar-Bestand mit 10 ml hESFM.</li>
		<li>Bereiten Sie 10 mM MK571 Vorrat vor, indem Sie 5 mg Pulver (537,07 g/mol) in 931 l auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M MK571 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM MK571 Lager mit 10 ml hESFM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach 1 Stunde die Zellen mit 10 M Rhodam 123 (ABCB1-Substrat) oder 10 M 2',7'--Dichlorodihydrofluorescein-Diaacetat (H2DCFDA, ABCC1-Substrat) mit oder ohne ihre jeweiligen Inhibitoren 1 Stunde bei 37 °C inkubieren.<ol>
<li>Bereiten Sie 10 mM Rhodamin 123 vor, indem Sie 10 mg Pulver (380,82 g/mol) in 875 l DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M Rhodamine 123 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM Rhodamine 123 Mit 10 ml hESFM.</li>
		<li>Bereiten Sie 10 mM H2DCFDA vor, indem Sie 50 mg Pulver (487,29 g/mol) in 10,26 ml DMSO auflösen und auf eine Arbeitskonzentration von 10 m verdünnen. Um z. B. 10 ml hESFM mit 10 M Rhodamine 123 herzustellen, mischen Sie 10 l von 10 mM Rhodamine 123 Mit 10 ml hESFM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie Zellen zweimal mit 0,5 ml DPBS und Lyse mit DPBS, die 5% Triton-X (v/v) enthalten.</li>
	<li>Messen Sie die Fluoreszenz der lysierten Zellen mit einem Multi-Platten- oder Mikroplattenleser (siehe Materialliste).<ol>
<li>Stellen Sie das Fluoreszenzplattenleser-Instrument auf 485 Nanometer Anregung und 530 Nanometer-Emission ein und messen Sie die Fluoreszenz bei diesen Wellenlängen.</li>
		<li>Für Brunnen, die nicht im Transportertest verwendet werden, waschen Sie Zellen zweimal mit DPBS, bevor Sie sie mit 4% PFA für die Zellkernquantifizierung fixieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen mit Hoechst 33342 Trihydrochlorid-Trihydrat verdünnt (1:1000) in DPBS für 10 Minuten. Bild mehrere visuelle Felder in jedem Brunnen, um die durchschnittliche Anzahl von Zellkernen mit Fluoreszenzmikroskopen zu berechnen.</li>
	<li>Zählen Sie Kerne mit Fidschi und normalisieren Sie Fluoreszenzwerte pro Zelle auf diese Zählungen.<ol>
<li>Berechnen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzakkumulation, indem Sie den Rohfluoreszenzakkumulationswert für jede Bedingung von ihrem jeweiligen Rohwert subtrahieren.</li>
		<li>Durchschnittliche subtrahierte Werte für jede Bedingung.</li>
		<li>Teilen Sie Durchschnittswerte aus Schritt 9.6.1 durch die durchschnittliche Zellenanzahl. Verwenden Sie diese Werte, um Fluoreszenzwerte pro Zelle zu normalisieren.</li>
		<li>Verwenden Sie normalisierte Werte, um eine grafische Darstellung für jede Inhibitorbedingung zu generieren und alle erforderlichen statistischen Analysen durchzuführen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. Passieren, Erweitern und Kryokonservierung von BMECs
<ol><li>Tag 8 BMEC-Kulturen mit frischem hESFM auffüllen, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27 und lassen Die Zellen auf der COL4/FN-Matrix noch zwei Tage expandieren.</li>
	<li>Beschichten Sie eine neue 12-Transwell-gefilterte Platte und eine 24-Well-Flachbodenplatte mit 400 g/mL COL4 und 100 g/mL FN und brüten 4 Stunden lang.</li>
	<li>Am 10. Tag die Zellen mit DPBS waschen und mit 1 ml enzymatischer EDTA mindestens 15 Minuten bei 37 °C inkubieren, bis eine Einzelzellsuspension erhalten ist.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.<ol>
<li>Um diese Zellen kryokonservieren, setzen Sie Zellpellets mit frischem hESFM mit 30% Fetal Bovine Serum (FBS) und 10% DMSO wieder auf.</li>
		<li>IPSC-abgeleitete BMECs in kryokonservierten Fläschchen in einem Isopropanol-Behälter für die ersten 24 Stunden bei -80 °C lagern und dann in flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung bei -160 °C geben.</li>
		<li>Um diese Zellen zu durchleben, setzen Sie Zellpellets mit frischem hESFM, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27, wieder auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Samenzellen auf beschichteten Platten, die in Schritt 10.2 hergestellt werden. Samenzellen mit einem Verhältnis von 1 Brunnen einer 6-Well-Platte zu 3 Brunnen einer 12-Transwell-gefilterten Platte und zu 6 Brunnen einer 24-Well-Platte. Lassen Sie Zellen 24 Stunden lang wachsen und erweitern.</li>
	<li>Messen Sie TEER am 11. Tag anhand der in Schritt 8 aufgeführten Schritte.</li>
	<li>Führen Sie am 12. Tag ICC aus, indem Sie die in Schritt 9 aufgeführten Schritte ausführen.</li>
	<li>Um kryokonservierte BMECs aufzutauen, legen Sie die kryokonservierten Fläschchen in ein warmes Wasser oder Perlenbad bei 37oC. Dann übertragen Sie die aufgetauten BMECs auf 5 ml hESFM, ergänzt durch verdünntes (1:200) B27.<ol>
<li>Sammeln Sie Zellen über Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Setzen Sie die Zellen in hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27, 10 M RA und 10 M Y-27632.</li>
		<li>Nach 24 Stunden schalten Sie Medium auf hESFM, ergänzt durch verdünnte (1:200) B27 und 10 'M Y-27632 ohne RA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Änderungen und Fehlerbehebung
In diesem Protokoll haben wir einige Änderungen bei der Verwendung einer häufig verwendeten extrazellulären Matrix und Zellkulturmedien während der iPSC-Kultivierung für die Ableitung von BMECs vorgenommen (Abbildung 1). Diese Änderungen hatten keinen Einfluss auf die Fähigkeit, BMECS aus menschlichen iPSCs abzuleiten, wie im Lippmann-Protokoll1beschrieben. Eine iPSC-Leitung eines ander...

Blut-Hirn-Barriere-Funktion Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) bildet eine Grenze, die die Bewegung von Substanzen aus dem Blut zum Gehirn einschränkt. Die BBB besteht aus mikrovaskulären Endothelzellen (BMECs) des Gehirns, die eine Monoschicht bilden, die die Vaskulatur auskundaufzen. BMECs bilden zusammen mit Astrozyten, Neuronen, Pericyten, Mikroglia und extrazellulärer Matrix die neurovaskuläre Einheit. BMECs haben eine streng regulierte parazelluläre Struktur, die es dem BBB ermöglicht, einen hohen transendotheliaalen elektrischen Widerstand (TEER) aufrechtzuerhalten, der die passive Diffusion begrenzt und als Indikator für die Barriereintegrität1,2dient. BMECs haben auch Proteine, die bei der transzellulären Bewegung wie Endozytose, Transzytose und Transmigration sowie Extravasation von Leukozyten während einer Immunantwort unterstützen3. BMECs sind auf Zustrom- und Efflux-Transporter für die Ernährung und Entfernung von Abfallprodukten angewiesen, um ein heimelatisativer Gleichgewicht im Gehirn zu halten3. So ist beispielsweise die Solute Carrier Family 2 Member 1 (SLC2A1) ein Zustromtransporter, der für die Bewegung von Glukose über die BBB4verantwortlich ist, während Efflux-Transporter wie die ATP-Bindungskassette Unterfamilie B Member 1 (ABCB1) und die ATP-Bindungskassette Unterfamilie C Member 1 (ABCC1) für die Rückführung von Substraten in den Blutkreislauf verantwortlich sind3,5,6,7. ABCB1-Substrate sind Morphin, Verapamil4und Antipsychotika wie Olanzapin und Risperidon8, während der ABCC1-Transporter eine Vielzahl von Substraten hat, einschließlich Sulfatkonjugate, Vincrinin und Glucuronid-Konjugate4.
Anwendung von BBB-Modellen bei psychiatrischen Störungen BBB Dysfunktion wurde in eine Reihe von neurologischen und psychiatrischen Störungen verwickelt, einschließlich Schizophrenie und bipolare Störung9,10. Kürzlich werden iPSC-abgeleitete ex vivo-Zellmodelle verwendet, um die zellulären und molekularen Grundlagen psychiatrischer Störungen zu hinterfragt, aber diese Modelle berücksichtigen derzeit nicht die potenzielle Rolle, die die Neurovaskulatur11,12,13spielt. Es wird vermutet, dass periphere entzündliche Zytokine, die im Blut zirkulieren, die BBB14,15,16,17, aber es gibt auch Beweise für parazelluläre18,19,20,21,22, transzellulär23,24,25,26,27,28,29und extrazelluläre Matrix20,29,30,31,32 Anomalien, die zur BBB Dysfunktion beitragen. Eine Störung des BBB kann dazu führen, dass der Inhalt des Blutes in das Blut parenchyma eintritt und aktivierte Astrozyten und/oder Mikroglia, um proinflammatorische Zytokine freizusetzen, die wiederum eine Entzündungsreaktioninitiieren 33, die schädliche Auswirkungen auf das Gehirn haben kann34. BMECs sind die primäre Komponente der BBB und die Untersuchung der Struktur und Funktion dieser Zellen kann das Verständnis der BBB Dysfunktion bei neurologischen und psychiatrischen Störungen verbessern.
Alternative BMEC-Modelle Vor der Entwicklung effizienter Protokolle zur Ableitung von BMECs aus iPSCs1,6,35,36hatten Forscher verewigte BMECs37 eingesetzt, um die BBB-Funktion zu untersuchen. Viele dieser Modelle erreichten jedoch keine wünschenswerten BBB-Phänotypen, wie einen physiologischen Bereich von TEER-Werten38,39. Die Verwendung von iPSCs hat den Vorteil, dass der genetische Hintergrund des Individuums, aus dem die Zellen abgeleitet sind, erhalten bleibt. Wissenschaftler arbeiten aktiv an der Entwicklung von iPSC-abgeleiteten ex-vivo-Mikroumweltmodellen, die die Struktur und Funktion des menschlichen Gehirns rekapitulieren. Die Forscher haben Methoden entwickelt, um BMECs abzuleiten, die strukturell und physiologisch ähnlich wie BMECs sind,die in vivo gefunden werden. Methoden zur Gewinnung gereinigter Populationen von iPSC-abgeleiteten BMECs erfordern eine Reihe verschiedener Schritte, wobei Protokolle in den letzten Jahren optimiert wurden1,6,35,36. Im Allgemeinen werden iPSC-abgeleitete BMECs in Essential 6 (E6) Medium für 4 Tage kultiviert, gefolgt von 2 Tagen in humanen endothelialen Serum-freien Medium (hESFM) ergänzt mit grundlegenden Fibroblast wachstumsfaktor (bFGF), Retinsäure (RA), und B27 Ergänzung. Die Zellen werden dann auf einer Kollagen-IV-Matrix (COL4) und Fibronectin (FN) kultiviert, um >90% homogene BMECs1zu erhalten.
Die Identität von BMECs wird durch Immunfluoreszenz bestätigt, die die Koexpression von BMEC-Proteinen einschließlich Thrombozyten-Endothel-Zelladhäsionsmolekül-1 (PECAM1), SLC2A1 und engen Knotenproteinen wie engem Knotenprotein 1 (TJP1), Occludin (OCLN) und Claudin-5 (CLDN5)6zeigt. Sprouting-Assays wurden verwendet, um das angiogene Potenzial von iPSC-abgeleiteten BMECs zu bestätigen. 6 Die BBB-Integrität von BMECs wird durch das Vorhandensein physiologischer in vitro TEER-Werte (2000 x cm2)37 und messbare Aktivität für Efflux-Transporter wie ABCB1 und ABCC11,6,36. Jüngste methodische Fortschritte der Lippmann-Gruppe haben zu iPSC-abgeleiteten BMEC-Protokollen mit reduzierter experimenteller Variabilität und verbesserter Reproduzierbarkeit1geführt. Es ist jedoch nicht bekannt, ob sie über die Unterkultivierungsstufe hinaus erweitert und durchdrungen werden können. Unser modifiziertes Protokoll zielt darauf ab, dieses Problem zu lösen, indem iPSC-abgeleitete BMECs über Tag 8 hinaus übergeben und bewertet werden, ob sie weiter ausgebaut werden können, um BBB-Eigenschaften nach der Kryokonservierung beizubehalten. Obwohl keine Studien die Passage von iPSC-abgeleiteten BMECs beschrieben haben, existiert ein Protokoll für die BMEC-Kryokonservierung, das physiologische BBB-Eigenschaften behält, nachdem sie einen Frost-Tau-Zyklus40durchlaufen haben. Es ist jedoch nicht bekannt, dass BMECs nach der Kryokonservierung durchundlassen und BBB-Eigenschaften behalten können.
BMECs, die von iPSCs mit dem Lippmann-Protokoll abgeleitet wurden, wurden verwendet, um BBB-Störungen bei neurologischen Erkrankungen wie der Huntington-Krankheit zu modellieren7. Solche iPSC-abgeleiteten BMECs wurden auch verwendet, um die Auswirkungen von bakteriellen Infektionen wie Neisseria meningitidis oder Gruppe B Streptococcus auf Störung der Blut-CSF-Barriere und BBB bzw.41,42zu untersuchen. Auch mit iPSC-abgeleiteten BMECs von 22q-Deletion-Syndrom-Patienten mit Schizophrenie, Forscher beobachteten eine Zunahme der interzellulären AdhäsionMolekül-1 (ICAM-1), ein wichtiges Adhäsionsmolekül in BMECs, die bei der Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten in das Gehirn43helfen. Zusammengenommen zeigen diese Studien den Nutzen von iPSC-abgeleiteten BMECs für die Untersuchung von BBB-Störungen bei komplexen neuropsychiatrischen Störungen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMECs) im Gehirn können von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unterschieden werden, um ex vivo-Zellmodelle zur Untersuchung der Funktion der Blut-Hirn-Schranke (BBB) zu entwickeln. Dieses modifizierte Protokoll enthält detaillierte Schritte zum Ableiten, Erweitern und Kryokonservieren von BMECs von menschlichen iPSCs, die einen anderen Spender und Reagenzien verwenden als in früheren Protokollen. iPSCs werden mit essentiellen 6 Medium für 4 Tage behandelt, gefolgt von 2 Tagen menschlichen endothelialen Serum-freien Kulturmedium mit grundlegenden Fibroblast wachstumsfaktor, Retinsäure, und B27 Ergänzung ergänzt. An Tag 6 werden die Zellen 2 Tage lang auf eine Kollagen-Fibronectin-Matrix subkultiviert. Die Immunzytochemie wird an Tag 8 für die BMEC-Markeranalyse mit CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 und SLC2A1 durchgeführt. Western Blotting wird durchgeführt, um den BMEC-Markerausdruck und das Fehlen von SOX17, einem endodermalen Marker, zu bestätigen. Angiogenic Potenzial wird mit einem keimenden Assay demonstriert. Der transendotheliale elektrische Widerstand (TEER) wird ab Tag 7 mit Essstäbchenelektroden und Voltohmmeter gemessen. Die Efflux-Transporteraktivität für die ATP-Bindungskassette Unterfamilie B-Mitglied 1 und die ATP-Bindungskassette Unterfamilie C-Mitglied 1 wird an Tag 8 mit einem Mehrplattenleser gemessen. Die erfolgreiche Ableitung von BMECs wird durch das Vorhandensein relevanter Zellmarker, niedrige SOX17-Spiegel, angiogenes Potenzial, Transportaktivität und TEER-Werte Ω x cm2bestätigt. BMECs werden bis zum 10. Tag erweitert, bevor sie auf frisch beschichtete Kollagen-/Fibronectinplatten oder Kryopreservede übergeben werden. Dieses Protokoll zeigt, dass iPSC-abgeleitete BMECs mindestens einmal erweitert und durchlaufen werden können. Nach der Kryokonservierung wurden jedoch niedrigere TEER-Werte und eine schlechtere Lokalisierung von BMEC-Markern beobachtet. BMECs können in Co-Kultur-Experimenten mit anderen Zelltypen (Neuronen, Glia, Pericyten), in dreidimensionalen Gehirnmodellen (Organ-Chip und Hydrogel), zur Vaskularisierung von Hirnorganoiden und zur Untersuchung von BBB-Dysfunktion bei neuropsychiatrischen Störungen eingesetzt werden.

BMEC-Differenzierung Einige kritische Schritte in diesem Protokoll sollten genau befolgt werden (Abbildung 1). E6 mittlere Nutzung an Tag 1 ist wichtig, da es oft für die Ableitung von Neuroektoderm Linie von iPSCs innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums, die reproduzierbare Ergebnisse über mehrere Zelllinien36. Ein weiterer wichtiger Schritt ist der 4. Tag der Differenzierung, bei dem E6-Medium auf hESFM mit verdünnten (1:200) B27, 20 ng/mL bF...

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Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dieses Protokoll beschreibt eine angepasste Methode zur Ableitung, Erweiterung und Kryokonservierung mikrovaskulärer Endothelzellen des Gehirns, die durch Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, und zur Untersuchung der Eigenschaften der Bluthirnschranke in einem Ex-vivo-Modell.

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

derivation-expansion-cryopreservation-characterization-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.2K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital. Dieses Protokoll beschreibt eine angepasste Methode zur Ableitung, Erweiterung und Kryokonservierung mikrovaskulärer Endothelzellen des Gehirns, die durch Differenzierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, und zur Untersuchung der Eigenschaften der Bluthirnschranke in einem Ex-vivo-Modell.

Serie: Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolierung der primären murinen Skelettmuskulatur mikrovaskuläre Endothelzellen

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...