このプロトコルには、花粉トラップを使用した角質花粉の収集、色による花粉の選別、およびアセト分解の3つの方法が記載されています。これらの方法は、受粉効率、花粉媒介者の採餌動態、食事の質と多様性など、花粉媒介者に関連する研究で一般的に使用されています。花粉トラップは、ミツバチのコロニーから大量の花粉を収集する簡単な方法です。
花粉ペレットを色で分類することは、専門知識を必要としない花粉を分類するための手頃な方法であり、アセトリシスにより、各ペレットの色に関連する植物分類群を特定できます。手順を実演するのは、教員研究助手のエレン・トピッツホーファーと、私の研究室の大学院研究助手であるエミリー・カーソンです。まず、目的の養蜂場の場所から花粉を捕獲する時期を決定し、花粉を捕獲するのに最適なミツバチのコロニーを選択します。
コロニーの入り口に戻る採餌者を2分間カウントしてコロニーの強度を評価し、戻ってきた採餌者の総数が最も多いコロニーを選択します。できれば余分な入り口やゆがんだ蓋のない、良好な状態の木製製品を備えたじんましんを選択してください。そのようなコロニーに戻る採餌蜂はトラップの入り口に向きを変える可能性が高いため、代替の入り口が少ないコロニーを使用してください。
可能な限り、南向きのハイブの入り口を選択してください。じんましんがパレット化されている場合は、特定のパレットの同じ方向を向いているすべてのコロニーに花粉トラップを設置して、採餌者が隣接する巣箱の入り口に漂流するのを防ぎます。必要に応じて、幼虫の存在についてフレームを検査することによってコロニーのひなの巣を評価し、比較的大量の幼虫がいるコロニーを選択します。
次に、選択したミツバチのコロニーに花粉トラップを取り付けます。フロントマウントトラップの場合は、ステープル、ネジ、テープで入り口の前にトラップを取り付けるか、トラップをハイブに巻き付けられたバンジーコードに接続します。コロニーへの他のすべての可能な入り口を、ラテックスやポリウレタンフォーム、またはオーガー穴用の8番のハードウェアクロスなどの非粘着性で成形可能な材料でシールします。
小さなひび割れには粘着テープを使用してください。地上の巣箱にあるフロントマウントトラップを使用する場合は、露による湿気による損傷を避けるために、収集バスケットと草の間にゴムマットなどのバリアを配置します。設置から24時間後、その日の採餌飛行が始まる前に、花粉トラップの捕獲メカニズムを作動させます。
収集トレイから特定の花粉を収集し、ビニール袋または遠心チューブに入れてから、氷を入れたクーラーボックスに保管します。スクーパーまたは大きなスプーンを使用して、代表的なサブサンプルとして10グラムの花粉をすくい取ります。サブサンプルからすべてのミツバチの部分と破片を取り除き、花粉の色とテクスチャの両方を使用して10グラムのサブサンプルの各花粉ペレットをカラーグループに分類し、グループを区別します。
下流工程で各色グループの少なくとも0.25グラムを確保するには、少なくとも0.25グラムの色グループを形成するのに十分に豊富ではないペレットをその他のグループに配置します。Pantoneカラーガイドを使用して、個々のカラーグループに名前を付けます。各カラーグループから0.25グラムの花粉ペレットを量ります。
適切なPPEを着用してください。次に、500グラムの色群花粉を含む各微量遠心管に0.25マイクロリットルの氷酸性酸をゆっくりと加えます。チューブを目視検査しながら、きれいなつまようじで花粉を10〜15秒間かき混ぜます。
サンプルを1、100倍Gで3分間遠心分離し、上清を酸廃ビーカーにデカントします。アセト分解混合物を調製するには、ビーカー標識アセトン分解混合物に10.8ミリリットルの氷酸性を加えます。次に、原液から1, 200マイクロリットルの濃硫酸をゆっくりと加えます。
各チューブに1, 000マイクロリットルのアセト分解混合物をゆっくりと加え、きれいなつまようじで10〜15秒間攪拌します。摂氏80度に予熱したヒートブロックにサンプルを置きます。チューブを5分間インキュベートし、インキュベーションの途中できれいなつまようじで各チューブを完全に攪拌します。
インキュベーション後、500マイクロリットルの氷酢酸を各チューブにゆっくりと加え、きれいなつまようじで10〜15秒間攪拌します。サンプルを遠心分離し、各チューブの上清を酸廃ビーカーにデカントします。各チューブに1, 000マイクロリットルの蒸留水を加え、きれいなつまようじで攪拌することにより、各サンプルを水で3回すすぎます。
サンプルを遠心分離し、上清をチューブから重曹のビーカーにデカントします。その後、水すすぎをさらに2回繰り返します。エタノールビーカーから各チューブに1, 000マイクロリットルの95%エタノールを加え、きれいなつまようじでかき混ぜます。
次に、サンプルを遠心分離し、上清をチューブからエタノール廃ビーカーにデカントします。サフラニン-O染色ストック溶液を混合し、各チューブに5〜10滴を加えます。つまようじで10〜15秒間かき混ぜ、つまようじをチューブに入れたままにします。
エタノールビーカーから1, 000マイクロリットルの95%エタノールを各チューブに加えて攪拌する。サンプルを遠心分離した後、上清をエタノール廃ビーカーにデカントします。各チューブに10〜15滴のグリセリンを加え、内容物を10〜15秒間攪拌します。
チューブをヒュームフードで開いたままにして、周囲の室温で少なくとも2時間エタノールを蒸発させます。花粉識別用の顕微鏡スライドにラベルを付けます。チューブから花粉残留物を1滴取り除き、ラベル付けされた顕微鏡スライドの中央に配置し、滴がわずかに広がるようにします。
スライドのドロップの上にきれいなカバースリップを置き、透明なマニキュアでカバースリップをスライドに密封します。記載された方法を使用して、花粉を収集し、色で分類し、各ペレット色グループの植物源を特定して花粉の多様性を評価しました。すべての花粉収集サンプルには、複数の識別可能な色グループがありました。
いくつかのサンプルでは、花粉の色グループはわずか4〜5個のペレットを含んでいました。しかし、ほとんどのグループは有意に多く、アセト分解のための独自の標識色グループとして機能しました。アセト分解後、明視野光学顕微鏡を用いて、各調査地周辺から採取したバウチャー標本の形態学的特徴と形態学的特徴を確認することにより、各色群を可能な限り低い分類学的ランクに効果的に識別した。
アーモンド作物の場所から収集された花粉は、他の作物から収集された花粉よりも花粉の多様性が比較的低く、サイトあたり3.2の植物分類群で平均3つのペレット色があり、選別された花粉は、ミツバチの飼料植物に見られる農薬を解明するための農薬をテストしたり、ミツバチに対する栄養価を決定するために化学組成を分析したりすることができます。この研究の結果は、コロニーによって収集された花粉で観察された種の多様性に関する貴重な洞察を提供し、アーモンド作物システムで収集された花粉の多様性が大幅に低いことを浮き彫りにしました。
