Três métodos são descritos neste protocolo: coleta de pólen corbicular usando armadilhas de pólen, triagem de pólen por cor e acetólise. Esses métodos são comumente utilizados em estudos relacionados a polinizadores, como eficiência de polinização, dinâmica de forrageamento de polinizadores e qualidade e diversidade da dieta. A captura de pólen é uma maneira fácil de coletar quantidades em massa de pólen de colônias de abelhas.
A classificação de pelotas de pólen por cor é um método acessível para classificar pólen que requer baixa experiência, e a acetólise permite identificar o imposto da planta associado a cada cor de pelota. Demonstrando o procedimento estarão Ellen Topitzhofer, assistente de pesquisa do corpo docente, e Emily Carson, assistente de pesquisa de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, determine quando capturar pólen do local apiário desejado e selecione as colônias de abelhas ideais para capturar pólen.
Avalie a força da colônia contando os forasteiros que retornam à entrada da colônia por dois minutos e, em seguida, selecione colônias com o maior número total de forasteiros retornando. Selecione colmeias com madeiras que estão em boas condições, de preferência sem entradas extras e tampas deformadas. Use colônias com menos entradas alternativas, pois abelhas invasoras que retornam a essas colônias são mais propensas a reorientar para a entrada da armadilha.
Selecione entradas de colmeia voltadas para o sul sempre que possível. Se as colmeias forem paletizadas, instale armadilhas de pólen em cada colônia que esteja na mesma direção em uma determinada paleta para evitar a deriva de forasteiros nas entradas de colmeias vizinhas. Se desejar, avalie o ninho de ninhadas da colônia inspecionando quadros para a presença de larvas e selecione colônias com quantidades relativamente grandes de larvas.
Em seguida, instale armadilhas de pólen nas colônias de abelhas selecionadas. Para armadilhas de montagem frontal, conecte a armadilha na frente da entrada com grampos, parafusos e fita, ou conecte a armadilha a cabos de bungee enrolados ao redor da colmeia. Sele todas as outras entradas possíveis na colônia com um material não adesivo e moldável, como látex ou espuma de poliuretano ou um pano de hardware número oito para buracos de auger.
Use fita adesiva para pequenas rachaduras. Se usar armadilhas de montagem frontal que estão em colmeias de nível terrestre, coloque uma barreira como um tapete de borracha entre a cesta de coleta e a grama para evitar danos causados pela umidade do orvalho. Acione o mecanismo de captura da armadilha de pólen 24 horas após a instalação e antes do início do voo de forrageamento do dia.
Colete pólen corbicular particular da bandeja de coleta e coloque-o em sacos plásticos ou tubos de centrífugas, em seguida, armazene-o em um refrigerador com gelo. Use o scooper ou uma colher grande para colher 10 gramas de pólen como sub-amostra representativa. Remova todas as partes e detritos das abelhas da sub amostra e, em seguida, classifique cada pelota de pólen da sub-amostra de 10 gramas em um grupo de cores usando cor e textura de pólen para diferenciar entre grupos.
Para garantir pelo menos 0,25 gramas de cada grupo de cores para degraus a jusante, coloque quaisquer pelotas que não sejam abundantes o suficiente para formar um grupo de cores de pelo menos 0,25 gramas em um grupo diverso. Nomeie cada grupo de cores individual usando o Guia de Cores Pantone. Pesar 0,25 gramas de pelotas de pólen de cada grupo colorido.
Doe o EPI apropriado. Em seguida, adicione lentamente 500 microliters de ácido ácido glacial a cada tubo de microcentrifuuge contendo 0,25 gramas de pólen de grupo colorido. Enquanto inspeciona visualmente o tubo, mexa o pólen com um palito limpo por 10 a 15 segundos.
Centrifugar a amostra por três minutos a 1.100 vezes G, depois decantar o sobrenante no béquer de resíduos ácidos. Para preparar a mistura de acetrólise, adicione 10,8 mililitros de ácido ácido glacial à mistura de acetrólise rotulada de béquer. Em seguida, adicione lentamente 1.200 microliters de ácido sulfúrico concentrado da solução de estoque.
Adicione lentamente 1.000 microliters de mistura de acetrólise a cada tubo e mexa com um palito limpo por 10 a 15 segundos. Coloque as amostras em um bloco de calor pré-aquecido a 80 graus Celsius. Incubar os tubos por cinco minutos, mexendo cada tubo completamente com um palito limpo no meio da incubação.
Após a incubação, adicione lentamente 500 microliters de ácido acético glacial a cada tubo e mexa com um palito limpo por 10 a 15 segundos. Centrifugar as amostras, em seguida, decantar o sobrenante de cada tubo para o béquer de resíduos ácidos. Enxágüe cada amostra três vezes com água adicionando 1.000 microliters de água destilada em cada tubo e mexendo com um palito limpo.
Centrifugar as amostras e decantar o supernatante dos tubos no béquer de bicarbonato de sódio. Em seguida, repita as lavades de água mais duas vezes. Adicione 1.000 microliters de 95% de etanol do béquer de etanol a cada tubo e mexa com um palito limpo.
Em seguida, centrifugar as amostras e decantar o sobrenante dos tubos para o béquer de resíduos de etanol. Misture a solução de calção de manchas safranin-O e adicione de 5 a 10 gotas a cada tubo. Mexa com um palito de dente por 10 a 15 segundos e deixe o palito no tubo.
Adicione 1.000 microliters de 95% de etanol do béquer de etanol a cada tubo e mexa. Depois de centrifugar as amostras, decantar o supernante no béquer de resíduos de etanol. Adicione 10 a 15 gotas de glicerina em cada tubo e mexa o conteúdo por 10 a 15 segundos.
Deixe os tubos abertos no capô da fumaça para evaporar o etanol por pelo menos duas horas em temperatura ambiente. Slides de microscópio de etiqueta para identificação de pólen. Remova uma gota de resíduo de pólen de um tubo e coloque-a no centro de seu slide de microscópio rotulado, permitindo que a gota se espalhe ligeiramente.
Coloque uma tampa limpa sobre a gota no slide e sele o deslizamento da tampa para o slide com esmalte transparente. Utilizando os métodos descritos, foi coletado pólen corbicular, classificado por cor, e as fontes vegetais de cada grupo de cor de pelotização foram identificadas para avaliar a diversidade de pólen. Cada amostra de coleta de pólen tinha múltiplos grupos de cores distinguíveis.
Em algumas amostras, os grupos de cores de pólen continham apenas quatro a cinco pelotas. No entanto, a maioria dos grupos tinha significativamente mais, e serviu como seu próprio grupo de cores rotulado para acetolise. Após acetolise, a microscopia de luz de campo brilhante foi usada para identificar efetivamente cada grupo de cor para sua classificação taxonômica mais baixa possível, confirmando as características morfológicas com as amostras de voucher coletadas da área ao redor de cada local de estudo.
O pólen coletado em locais de cultivo de amêndoas apresentou diversidade de pólen relativamente menor do que o pólen coletado de outras culturas, com uma média de três cores de pelotas em 3,2 taxas vegetais por local O pólen classificado pode ser testado para pesticidas para elucidar os agrotóxicos encontrados em plantas forrageiras de abelhas, ou analisado para composição química para determinar seu valor nutricional às abelhas. Os resultados desta pesquisa forneceram insights valiosos sobre a diversidade de espécies observadas no pólen coletado pelas colônias, destacando a diversidade substancialmente baixa de pólen coletada nos sistemas de cultivo de amêndoas.
