В этом протоколе описаны три метода: сбор корбикулярной пыльцы с помощью пыльцевых ловушек, сортировка пыльцы по цвету и ацетолиз. Эти методы обычно используются в исследованиях, связанных с опылителями, таких как эффективность опыления, динамика кормления опылителей, а также качество и разнообразие рациона. Улавливание пыльцы — это простой способ сбора объемных количеств пыльцы из колоний медоносных пчел.
Сортировка пыльцевых гранул по цвету является доступным методом классификации пыльцы, который требует низких знаний, а ацетолиз позволяет идентифицировать таксон растений, связанный с каждым цветом гранул. Демонстрировать процедуру будут Эллен Топитцхофер, научный сотрудник факультета, и Эмили Карсон, аспирант-исследователь из моей лаборатории. Для начала определите, когда ловить пыльцу с нужного места пасеки и выберите оптимальные колонии медоносных пчел для улавливания пыльцы.
Оцените силу колонии, подсчитав фуражиров, возвращающихся ко входу в колонию в течение двух минут, а затем выберите колонии с наибольшим общим количеством возвращающихся фуражиров. Выбирайте ульи с деревянной посудой, которая находится в хорошем состоянии, желательно без лишних входов и искривленных крышек. Используйте колонии с меньшим количеством альтернативных входов, так как пчелы-фуражиры, возвращающиеся в такие колонии, с большей вероятностью переориентируются на вход в ловушку.
По возможности выбирайте входы в улей, выходящие на юг. Если ульи упакованы на паллеты, установите пыльцевые ловушки на каждой колонии, обращенной в одном и том же направлении на данном поддоне, чтобы избежать дрейфа фуражиров в соседние входы ульев. При желании оцените расплодное гнездо колонии, осмотрев рамки на наличие личинок и выделите колонии с относительно большим количеством личинок.
Далее устанавливают пыльцевые ловушки на выбранные колонии медоносных пчел. Для ловушек с передним креплением прикрепите ловушку перед входом с помощью скоб, винтов и ленты или подключите ловушку к шнурам тарзанки, обернутым вокруг улья. Запечатайте все другие возможные входы в колонию неадгезионным и формуемым материалом, таким как латекс или пенополиуретан или аппаратная ткань номер восемь для отверстий шнека.
Используйте клейкую ленту для небольших трещин. При использовании ловушек переднего крепления, которые находятся на ульях на уровне земли, установите барьер, такой как резиновый коврик, между корзиной для сбора и травой, чтобы избежать повреждения влагой от росы. Включите механизм улавливания пыльцевой ловушки через 24 часа после установки и до начала дневного полета корма.
Соберите корбикулярную пыльцу из лотка для сбора и поместите ее в полиэтиленовые пакеты или центрифужные трубки, затем храните ее в холодильнике со льдом. Используйте совок или большую ложку, чтобы зачерпнуть 10 граммов пыльцы в качестве репрезентативного субобразца. Удалите все части пчелы и мусор из подобразца, затем отсортируйте каждую гранулу пыльцы из 10-граммового субобразца в цветовую группу, используя как цвет, так и текстуру пыльцы, чтобы различать группы.
Чтобы обеспечить не менее 0,25 грамма каждой цветовой группы для последующих этапов, поместите любые гранулы, которые недостаточно многочисленны, чтобы сформировать цветовую группу не менее 0,25 грамма, в другую группу. Назовите каждую отдельную цветовую группу с помощью Руководства по цвету Pantone. Взвесьте 0,25 грамма пыльцевых гранул из каждой цветовой группы.
Наденьте соответствующие СИЗ. Затем медленно добавляют 500 микролитров ледниковой кислотной кислоты в каждую микроцентрифужную трубку, содержащую 0,25 грамма пыльцы цветовой группы. При визуальном осмотре трубки перемешивайте пыльцу чистой зубочисткой в течение 10-15 секунд.
Центрифугируйте образец в течение трех минут при 1, 100 раз G, затем декантируйте супернатант в стакан кислотных отходов. Чтобы приготовить ацетолизную смесь, добавьте 10,8 миллилитра ледниковой кислотной кислоты в помеченную ацетолизную смесь. Затем медленно добавляют 1 200 микролитров концентрированной серной кислоты из исходного раствора.
Медленно добавляйте 1000 микролитров ацетолизной смеси в каждый тюбик и перемешивайте чистой зубочисткой в течение 10-15 секунд. Поместите образцы на тепловой блок, предварительно нагретый до 80 градусов Цельсия. Инкубируйте трубочки в течение пяти минут, тщательно перемешивая каждый тюбик чистой зубочисткой на полпути через инкубацию.
После инкубации медленно добавляйте 500 микролитров ледниковой уксусной кислоты в каждый тюбик и перемешивайте чистой зубочисткой в течение 10-15 секунд. Центрифугируйте образцы, затем декантируйте супернатант из каждой трубки в стакан кислотных отходов. Промойте каждый образец три раза водой, добавив 1000 микролитров дистиллированной воды в каждый тюбик и перемешав чистой зубочисткой.
Центрифугируйте образцы и декантируйте супернатант из трубок в стакан бикарбоната натрия. Затем повторите промывку водой еще два раза. Добавьте 1000 микролитров 95% этанола из этанолового стакана в каждый тюбик и перемешайте чистой зубочисткой.
Затем центрифугируйте образцы и декантируйте супернатант из трубок в стакан для отходов этанола. Смешайте раствор для окрашивания сафранин-О и добавьте от 5 до 10 капель в каждый тюбик. Перемешайте зубочисткой в течение 10-15 секунд и оставьте зубочистку в тюбике.
Добавьте 1000 микролитров 95% этанола из этанолового стакана в каждую трубку и перемешайте. После центрифугирования образцов декантируйте супернатант в стакан для отходов этанола. Добавьте от 10 до 15 капель глицерина в каждый тюбик и перемешивайте содержимое в течение 10-15 секунд.
Оставьте трубки открытыми в вытяжке, чтобы испарить этанол в течение не менее двух часов при комнатной температуре окружающей среды. Маркировка слайдов микроскопа для идентификации пыльцы. Извлеките одну каплю остатка пыльцы из трубки и поместите ее в центр меченого слайда микроскопа, чтобы капля слегка распространилась.
Поместите чистую крышку поверх капли на слайде и запечатайте крышку на слайде прозрачным лаком для ногтей. Используя описанные способы, корбикулярную пыльцу собирали, сортировали по цвету, и идентифицировали растительные источники каждой цветовой группы гранул для оценки разнообразия пыльцы. Каждый образец сбора пыльцы имел несколько различимых цветовых групп.
В некоторых образцах цветовые группы пыльцы содержали всего четыре-пять гранул. Тем не менее, большинство групп имели значительно больше и служили их собственной меченой цветовой группой для ацетолиза. После ацетолиза ярко-полевая световая микроскопия использовалась для эффективной идентификации каждой цветовой группы в ее минимально возможном таксономическом ранге путем подтверждения морфологических характеристик с характеристиками ваучерных образцов, собранных из области, окружающей каждый участок исследования.
Пыльца, собранная из мест выращивания миндаля, имела относительно более низкое разнообразие пыльцы, чем пыльца, собранная с других культур, в среднем три цвета гранул в 3,2 таксонах растений на участок Отсортированная пыльца может быть проверена на наличие пестицидов для выяснения агрохимикатов, обнаруженных на кормовых растениях медоносных пчел, или проанализирована на химический состав для определения ее питательной ценности для медоносных пчел. Результаты этого исследования предоставили ценную информацию о видовом разнообразии, наблюдаемом в пыльце, собранной колониями, подчеркнув существенно низкое разнообразие пыльцы, собранной в системах выращивания миндаля.
