이 프로토콜에는 꽃가루 트랩을 사용하여 corbicular 꽃가루 수집, 색상별로 꽃가루 정렬 및 acetolysis의 세 가지 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 수분 효율, 수분 매개체 채집 역학, 식단의 질 및 다양성과 같은 수분 매개체와 관련된 연구에서 일반적으로 사용됩니다. 꽃가루 포획은 꿀벌 식민지에서 대량의 꽃가루를 수집하는 쉬운 방법입니다.
꽃가루 펠릿을 색상별로 분류하는 것은 낮은 전문 지식이 필요한 꽃가루를 분류하는 저렴한 방법이며 acetolysis를 통해 각 펠릿 색상과 관련된 식물 분류군을 식별 할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 교수 연구 조교 인 Ellen Topitzhofer와 내 연구실의 대학원 연구 조교 인 Emily Carson입니다. 시작하려면 원하는 양봉장 위치에서 꽃가루를 포획 할시기를 결정하고 꽃가루를 포획하기위한 최적의 꿀벌 식민지를 선택하십시오.
2분 동안 식민지 입구로 돌아오는 채집인을 세어 식민지 강도를 평가한 다음 돌아오는 수렵채집 총수가 가장 많은 식민지를 선택합니다. 양호한 상태의 목재 제품이있는 두드러기를 선택하고, 여분의 입구와 뒤틀린 뚜껑이없는 것이 좋습니다. 대체 입구가 적은 식민지를 사용하면 그러한 식민지로 돌아 오는 채집 꿀벌이 트랩 입구로 방향을 바꿀 가능성이 더 큽니다.
가능하면 남향 벌집 입구를 선택하십시오. 벌통이 팔레 타이징 된 경우, 주어진 팔레트에서 같은 방향을 향한 모든 식민지에 꽃가루 트랩을 설치하여 채집자가 인접한 벌집 입구로 표류하는 것을 방지하십시오. 원하는 경우 유충의 존재 여부에 대한 프레임을 검사하여 식민지의 둥지를 평가하고 상대적으로 많은 양의 유충이있는 식민지를 선택하십시오.
다음으로, 선택한 꿀벌 식민지에 꽃가루 함정을 설치하십시오. 전면 장착 트랩의 경우 스테이플, 나사 및 테이프로 입구 앞에 트랩을 부착하거나 트랩을 하이브를 감싼 번지 코드에 연결합니다. 콜로니로 들어갈 수 있는 다른 모든 입구는 라텍스 또는 폴리우레탄 폼 또는 오거 구멍용 8번 하드웨어 천과 같은 비접착성 및 성형 가능한 재료로 밀봉합니다.
작은 균열에는 접착 테이프를 사용하십시오. 지면 벌통에있는 전면 장착 트랩을 사용하는 경우 이슬로 인한 습기 손상을 방지하기 위해 수집 바구니와 잔디 사이에 고무 매트와 같은 장벽을 배치하십시오. 설치 후 24 시간 및 하루의 채집 비행이 시작되기 전에 꽃가루 트랩의 포획 메커니즘을 작동하십시오.
수집 트레이에서 corbicular 특정 꽃가루를 수집하여 비닐 봉지 또는 원심 분리기 튜브에 넣은 다음 얼음이 든 쿨러에 보관하십시오. 스쿠퍼 또는 큰 숟가락을 사용하여 대표적인 하위 샘플로 10g의 꽃가루를 퍼냅니다. 하위 샘플에서 모든 꿀벌 부분과 파편을 제거한 다음 10g 하위 샘플의 각 꽃가루 펠릿을 꽃가루 색상과 질감을 모두 사용하여 색상 그룹으로 분류하여 그룹을 구별합니다.
다운스트림 단계에서 각 색상 그룹의 최소 0.25g을 보장하려면 최소 0.25g의 색상 그룹을 형성하기에 충분하지 않은 펠릿을 기타 그룹에 배치합니다. Pantone 색상 가이드를 사용하여 각 개별 색상 그룹의 이름을 지정합니다. 각 색상 그룹에서 0.25g의 꽃가루 알갱이의 무게를 잰다.
적절한 PPE를 착용하십시오. 그런 다음 500 그램의 컬러 그룹 꽃가루가 들어있는 각 마이크로 원심 분리기 튜브에 0.25 마이크로 리터의 빙산을 천천히 첨가하십시오. 튜브를 육안으로 검사하면서 깨끗한 이쑤시개로 꽃가루를 10-15 초 동안 저어줍니다.
시료를 1, 100배 G에서 3분간 원심분리한 다음, 상층액을 산성 폐기물 비이커에 넣는다. 아세톨분해 혼합물을 준비하려면 아세톨분해 혼합물이라고 표시된 비커에 10.8ml의 빙산을 추가합니다. 그런 다음 원액에서 1, 200 마이크로 리터의 진한 황산을 천천히 첨가하십시오.
천천히 1, 000 마이크로 리터의 아세토 분해 혼합물을 각 튜브에 넣고 깨끗한 이쑤시개로 10-15 초 동안 저어줍니다. 섭씨 80도로 예열된 열 블록에 샘플을 놓습니다. 배양 중간에 깨끗한 이쑤시개로 각 튜브를 완전히 저어 5 분 동안 튜브를 배양하십시오.
배양 후 각 튜브에 500 마이크로 리터의 빙초산을 천천히 넣고 깨끗한 이쑤시개로 10-15 초 동안 저어줍니다. 샘플을 원심분리한 다음 각 튜브의 상층액을 산성 폐기물 비커로 기울입니다. 각 튜브에 1, 000 마이크로 리터의 증류수를 넣고 깨끗한 이쑤시개로 저어 주어 물로 각 샘플을 3 번 헹굽니다.
샘플을 원심분리하고 튜브에서 상청액을 중탄산나트륨 비커로 디캔트합니다. 그런 다음 물 헹굼을 두 번 더 반복하십시오. 에탄올 비커에서 1, 000 마이크로 리터의 95 % 에탄올을 각 튜브에 넣고 깨끗한 이쑤시개로 저어줍니다.
그런 다음 샘플을 원심분리하고 튜브에서 상청액을 에탄올 폐기물 비커로 디캔트합니다. 사프라닌-O 염색 원액을 혼합하고 각 튜브에 5-10방울을 추가합니다. 이쑤시개로 10-15 초 동안 저어주고 이쑤시개를 튜브에 두십시오.
에탄올 비커에서 1, 000 마이크로 리터의 95 % 에탄올을 각 튜브에 넣고 저어줍니다. 샘플을 원심분리한 후, 상청액을 에탄올 폐기물 비이커 내로 디캔트한다. 각 튜브에 글리세린 10-15 방울을 넣고 내용물을 10-15 초 동안 저어줍니다.
흄 후드에서 튜브를 열어 두어 주변 실온에서 최소 2 시간 동안 에탄올을 증발시킵니다. 꽃가루 식별을 위해 현미경 슬라이드에 라벨을 붙입니다. 튜브에서 꽃가루 잔여물 한 방울을 제거하고 라벨이 붙은 현미경 슬라이드의 중앙에 놓고 방울이 약간 퍼지도록 합니다.
슬라이드의 방울 위에 깨끗한 커버 슬립을 놓고 투명 매니큐어로 커버 슬립을 슬라이드에 밀봉합니다. 설명 된 방법을 사용하여 corbicular 꽃가루를 수집하고, 색상별로 분류하고, 각 펠릿 색상 그룹의 식물 공급원을 식별하여 꽃가루 다양성을 평가했습니다. 모든 꽃가루 수집 샘플에는 여러 개의 구별 가능한 색상 그룹이 있습니다.
일부 샘플에서 꽃가루 색상 그룹에는 4-5 개의 펠릿이 포함되어 있습니다. 그러나 대부분의 그룹은 훨씬 더 많았으며 아세토 분해를위한 자체 표지 된 색상 그룹으로 사용되었습니다. 아세톨분해 후, 명시야 광학 현미경을 사용하여 각 연구 사이트 주변 영역에서 수집된 바우처 표본의 형태학적 특성을 확인하여 가능한 가장 낮은 분류학적 순위로 각 색상 그룹을 효과적으로 식별했습니다.
아몬드 작물 위치에서 수집 한 꽃가루는 다른 작물에서 수집 한 꽃가루보다 꽃가루 다양성이 상대적으로 낮았으며 사이트 당 3.2 개의 식물 분류군에서 평균 3 가지 펠릿 색상을 가졌습니다 분류 된 꽃가루는 꿀벌 사료 식물에서 발견되는 농약을 설명하기 위해 살충제를 테스트하거나 꿀벌에 대한 영양가를 결정하기 위해 화학 성분을 분석 할 수 있습니다. 이 연구의 결과는 콜로니가 수집 한 꽃가루에서 관찰 된 종 다양성에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 아몬드 작물 시스템에서 수집 된 꽃가루의 다양성이 상당히 낮다는 것을 강조했습니다.
