Trois méthodes sont décrites dans ce protocole : la collecte du pollen corbiculaire à l’aide de pièges à pollen, le tri du pollen par couleur et l’acétolyse. Ces méthodes sont couramment utilisées dans les études liées aux pollinisateurs, telles que l’efficacité de la pollinisation, la dynamique de recherche de nourriture des pollinisateurs et la qualité et la diversité de l’alimentation. Le piégeage du pollen est un moyen facile de collecter des quantités massives de pollen dans les colonies d’abeilles mellifères.
Le tri des granulés de pollen par couleur est une méthode abordable pour classer le pollen qui nécessite une faible expertise, et l’acétolyse permet d’identifier le taxon végétal associé à chaque couleur de granulés. Ellen Topitzhofer, assistante de recherche à la faculté, et Emily Carson, assistante de recherche diplômée de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, déterminez quand piéger le pollen à partir de l’emplacement rucher souhaité et sélectionnez les colonies d’abeilles optimales pour piéger le pollen.
Évaluez la force de la colonie en comptant les butineuses qui retournent à l’entrée de la colonie pendant deux minutes, puis sélectionnez les colonies avec le plus grand nombre total de butineuses qui reviennent. Choisissez des ruches en bois en bon état, de préférence sans entrées supplémentaires ni couvercles déformés. Utilisez des colonies avec moins d’entrées alternatives, car les abeilles butineuses qui retournent dans ces colonies sont plus susceptibles de se réorienter vers l’entrée du piège.
Choisissez des entrées de ruche orientées au sud dans la mesure du possible. Si les ruches sont palettisées, installez des pièges à pollen sur chaque colonie orientée dans la même direction sur une palette donnée pour éviter la dérive des butineuses dans les entrées de ruches voisines. Si vous le souhaitez, évaluez le nid de couvain de la colonie en inspectant les cadres pour détecter la présence de larves et sélectionnez des colonies avec des quantités relativement importantes de larves.
Ensuite, installez des pièges à pollen sur les colonies d’abeilles sélectionnées. Pour les pièges montés à l’avant, fixez le piège devant l’entrée avec des agrafes, des vis et du ruban adhésif, ou connectez le piège à des cordons élastiques enroulés autour de la ruche. Scellez toutes les autres entrées possibles dans la colonie avec un matériau non adhésif et moulable, tel que de la mousse de latex ou de polyuréthane ou un tissu de quincaillerie numéro huit pour les trous de tarière.
Utilisez du ruban adhésif pour les petites fissures. Si vous utilisez des pièges montés à l’avant qui se trouvent sur des ruches au niveau du sol, placez une barrière telle qu’un tapis de caoutchouc entre le panier de collecte et l’herbe pour éviter les dommages causés par l’humidité par la rosée. Enclenchez le mécanisme de piégeage du piège à pollen 24 heures après l’installation et avant le début du vol de recherche de nourriture de la journée.
Recueillez le pollen particulier corbiculaire du plateau de collecte et placez-le dans des sacs en plastique ou des tubes à centrifuger, puis conservez-le dans une glacière avec de la glace. Utilisez la cuillère ou une grande cuillère pour prélever 10 grammes de pollen comme sous-échantillon représentatif. Retirez toutes les parties et les débris d’abeilles du sous-échantillon, puis triez chaque pastille de pollen du sous-échantillon de 10 grammes dans un groupe de couleurs en utilisant à la fois la couleur et la texture du pollen pour différencier les groupes.
Pour assurer au moins 0,25 gramme de chaque groupe de couleurs pour les étapes en aval, placez les granulés qui ne sont pas assez abondants pour former un groupe de couleur d’au moins 0,25 gramme dans un groupe divers. Nommez chaque groupe de couleurs à l’aide du Guide des couleurs Pantone. Pesez 0,25 gramme de pastilles de pollen de chaque groupe de couleurs.
Enfilez l’EPI approprié. Ensuite, ajoutez lentement 500 microlitres d’acide glacial à chaque tube de microcentrifugation contenant 0,25 gramme de pollen de groupe de couleur. Tout en inspectant visuellement le tube, remuez le pollen avec un cure-dent propre pendant 10 à 15 secondes.
Centrifuger l’échantillon pendant trois minutes à 1 100 fois G, puis décanter le surnageant dans le bécher de déchets acides. Pour préparer le mélange d’acétolyse, ajoutez 10,8 millilitres d’acide glacial au mélange d’acétolyse marqué du bécher. Ensuite, ajoutez lentement 1 200 microlitres d’acide sulfurique concentré à partir de la solution mère.
Ajouter lentement 1 000 microlitres de mélange d’acétolyse à chaque tube et remuer avec un cure-dent propre pendant 10 à 15 secondes. Placez les échantillons sur un bloc de chaleur préchauffé à 80 degrés Celsius. Incuber les tubes pendant cinq minutes, en remuant soigneusement chaque tube avec un cure-dent propre à mi-chemin de l’incubation.
Après l’incubation, ajoutez lentement 500 microlitres d’acide acétique glacial à chaque tube et remuez avec un cure-dent propre pendant 10 à 15 secondes. Centrifuger les échantillons, puis décanter le surnageant de chaque tube dans le bécher de déchets acides. Rincer chaque échantillon trois fois avec de l’eau en ajoutant 1 000 microlitres d’eau distillée à chaque tube et en remuant avec un cure-dent propre.
Centrifuger les échantillons et décanter le surnageant des tubes dans le bécher de bicarbonate de sodium. Ensuite, répétez les rinçages à l’eau deux fois de plus. Ajouter 1 000 microlitres d’éthanol à 95% du bécher à éthanol à chaque tube et remuer avec un cure-dent propre.
Ensuite, centrifuger les échantillons et décanter le surnageant des tubes dans le bécher à déchets d’éthanol. Mélanger la solution de teinture safranin-O et ajouter 5 à 10 gouttes dans chaque tube. Remuer avec un cure-dent pendant 10 à 15 secondes et laisser le cure-dent dans le tube.
Ajouter 1 000 microlitres d’éthanol à 95% du bécher d’éthanol à chaque tube et remuer. Après avoir centrifugé les échantillons, décanter le surnageant dans le bécher à déchets d’éthanol. Ajouter 10 à 15 gouttes de glycérine dans chaque tube et remuer le contenu pendant 10 à 15 secondes.
Laissez les tubes ouverts dans la hotte pour évaporer l’éthanol pendant au moins deux heures à température ambiante. Étiqueter les lames de microscope pour l’identification du pollen. Retirez une goutte de résidu de pollen d’un tube et placez-la au centre de sa lame de microscope étiquetée, permettant à la goutte de se propager légèrement.
Placez un couvercle propre sur la goutte sur la lame et scellez le bordereau de couverture sur la lame avec du vernis à ongles transparent. À l’aide des méthodes décrites, le pollen corbiculaire a été recueilli, trié par couleur, et les sources végétales de chaque groupe de couleur de granulés ont été identifiées pour évaluer la diversité du pollen. Chaque échantillon de collecte de pollen avait plusieurs groupes de couleurs distincts.
Dans certains échantillons, les groupes de couleur du pollen contenaient aussi peu que quatre à cinq pastilles. Cependant, la plupart des groupes en avaient beaucoup plus et servaient de leur propre groupe de couleurs étiqueté pour l’acétolyse. Après l’acétolyse, la microscopie optique à fond clair a été utilisée pour identifier efficacement chaque groupe de couleurs à son rang taxonomique le plus bas possible en confirmant les caractéristiques morphologiques avec celles des spécimens de référence prélevés dans la zone entourant chaque site d’étude.
Le pollen collecté dans les sites de culture d’amandes avait une diversité pollinique relativement inférieure à celle du pollen collecté sur d’autres cultures, avec une moyenne de trois couleurs de granulés dans 3,2 taxons végétaux par site Le pollen trié peut être testé pour les pesticides afin d’élucider les produits agrochimiques trouvés sur les plantes fourragères d’abeilles mellifères, ou analysé pour la composition chimique afin de déterminer sa valeur nutritive pour les abeilles mellifères. Les résultats de cette recherche ont fourni des informations précieuses sur la diversité des espèces observée dans le pollen collecté par les colonies, soulignant la diversité substantiellement faible du pollen collecté dans les systèmes de culture des amandes.
